Western Blot技術應用：Western Blot（WB）是全球生命科學實驗室必備技術之一，WB最早是1979年由瑞士科學家Towbin報道，將SDS-PAGE電泳后的蛋白印記在NC膜上，再通過一抗和二抗標記并顯色的方法。四十年來，隨著標記和檢測技術的發(fā)展，WB已經(jīng)變得更加靈敏、快捷，新的抗體也使其應用范圍更加廣泛?？偨Y下來，WB主要可以用于以下幾個方面：
1. 定性分析——未知蛋白的鑒定；
2. 定量/半定量分析——樣本內(nèi)蛋白含量變化；
3. 蛋白構象分析——二硫鍵、PTM及寡聚化分析；
4. 信號分析——磷酸化、泛素化等信號分子的變化；
5. 標簽抗體的靈活運用——蛋白研究更加方便。
本期通過實戰(zhàn)舉例為大家介紹一下Western Blot技術的應用方向，也許你會發(fā)現(xiàn)WB還可以在您的科研工作中發(fā)揮更大的作用。
實例解析Western Blot應用
1、目標蛋白定性分析
現(xiàn)有對未知蛋白定性的方法有：
氨基酸測序；
基于質譜（MS）的肽指紋圖譜分析（電泳+MS/MS、HPLC+MS、MALDI-TOF）；
基于特異性抗體的方法（抗體芯片、WesternBlot）。
相對而言，前兩種方法耗時且對儀器設備要求高，而基于抗體的蛋白鑒定方法則比較方便快捷。
本文通過傳染性腸胃炎病毒（TGEV）感染豬睪丸細胞后的蛋白組學變化，發(fā)現(xiàn)23種蛋白上調(diào)，10種蛋白下調(diào)（圖A），并用WB鑒定角質蛋白19（keratin 19）、a-微管蛋白（a- tubulin）和抗增殖蛋白（prohibitin）（圖B）參與了病毒的感染過程，表明該病毒感染與細胞結構完整性、囊泡運輸及RNA處理、蛋白合成調(diào)控等有關。
2、目標蛋白定量/半定量分析
WB最經(jīng)典的用途及最主要的實驗目的就是對蛋白表達進行定量或半定量分析。
通過設置適當內(nèi)參蛋白，將感興趣的蛋白對內(nèi)參進行歸一化，即可比較試驗前后樣本中某蛋白相對含量的變化，即為半定量研究。
文中利用WB對目標蛋白進行了半定量研究。在這篇文章中，Rijn等通過WB方法發(fā)現(xiàn)先天性腹瀉（CDD）病人及其父母DGAT1蛋白表達缺失。作者通過DNA測序分析了DGAT基因，確定了DGAT1基因五個新的純合變異體，其RT-PCR發(fā)現(xiàn)cDNA異常切割，因此DGAT蛋白無表達。這造成細胞脂代謝異常。文章通過基因敲除法構建了DGAT1缺失型類小腸器官，還在Caco-2細胞系中重組表達了DGAT1和DGAT2，目的是體外模擬DGAT蛋白缺失及重建后對脂代謝的影響。類小腸器官及細胞系中DGAT蛋白的表達都是通過WB方法得以確定的。該實驗證實，敲除DGAT1蛋白造成脂代謝紊亂，對細胞造成脂毒性，重建DGAT1或DGAT2可恢復脂代謝。
3、目標蛋白構象結合功能分析
WB用于構象分析，主要基于其不同構象形式時分子量所發(fā)生的變化，比如不同的寡聚、翻譯后修飾、配體結合等情況。
還原和非還原型電泳分析鏈間二硫鍵，并判斷蛋白聚合情況；
抗體表位分析法初步判斷蛋白空間結構；
利用（N-端或C-端）抗體研究蛋白異構體及翻譯后酶切修飾；
更重要的是，WB等方法獲得的是蛋白在寡聚、結合配體、底物、信號標簽等生理條件下，其分子量的動態(tài)變化，從而將蛋白結構研究與功能研究有機結合。
泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)對于錯誤蛋白降解具有重要意義。左圖顯示Nrf2蛋白在泛素連接酶作用時間延長后，泛素化程度逐漸增加。若將各時間點的Nrf2蛋白結構解析，即可將該蛋白的結構研究與功能研究相結合。在Virology的這篇文獻中，作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG132和lactacystin可顯著降低豬II型圓環(huán)病毒（PCV2）早期感染的滴度，并通過對泛素基因的沉默實驗，發(fā)現(xiàn)其也顯著降低PCV2滴度，由此推斷泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是PCV2的早期復制所必須的。
案例Ⅱ
硝基化促使a-突觸核蛋白（a-synuclein）寡聚，以及寡聚化的a-synuclein促使人神經(jīng)膠質瘤細胞SH-SY5Y凋亡，并呈時間劑量效應的研究。WB結果顯示硝基化程度加深，a-synuclein呈現(xiàn)了二聚及多聚特性。硝基化的a-synuclein激活了iNOS并抑制了FAK，這兩條信號可能都參與了促SH-SY5Y凋亡作用。作者還發(fā)現(xiàn)integrin抗體部分抑制了細胞凋亡，將已有的integrin/FAK/caspase 3信號通路改變?yōu)閕ntegrin-iNOS/-FAK/caspase 3信號通路。
4、磷酸化信號分析
磷酸化是細胞信號系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)方式，特異的磷酸化抗體可以用于：
分析信號分子磷酸化水平，從而與其功能研究建立聯(lián)系；
分析不同磷酸化位點對于信號分子功能的影響，比如p53總磷酸化水平與不同位點磷酸化水平對轉錄的調(diào)控，以及與癌癥發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系。
Cai等在JBC上發(fā)表的文章，揭示了微小RNA在腫瘤發(fā)生中的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)微小RNA miR-17/20a靶向抑制p53的核心激酶DAPK3（死亡相關蛋白激酶3）的表達，去除這些微小RNA將導致依賴于p53的微小RNA轉錄抑制被去除，從而形成一個正反饋環(huán)，促進腫瘤形成，它們被稱為原癌微小RNA（oncomiRs）。C圖清楚顯示了當對Hela細胞轉入miR-17、miR-20a或miR-17/20a拮抗劑后，DAPK3蛋白表達增加，雙鏈DNA不穩(wěn)定性的標志物ATM（Ser-1981）、p53BP1（Ser-25/29）蛋白絲氨酸磷酸化程度增高，而各自總蛋白水平并沒有變化。D圖進一步確認了這些磷酸化水平升高是由DAPK3表達量升高引起的。p53磷酸化水平升高將導致其抑制原癌微小RNA轉錄的水平下降，進一步提高DAPK3激酶的表達。該研究補充了原有的通過E2F家族蛋白激活miR-17/20a的負反饋調(diào)節(jié)通路。
案例Ⅱ
糖尿病代謝紊亂可能會增加阿爾茨海默癥（AD病）風險，其病理機制是導致Ab和tau蛋白表達量的增加。在Clin Interv Aging雜志的文章中，作者發(fā)現(xiàn)四環(huán)素衍生藥物二甲胺四環(huán)素可降低糖尿病模型大鼠的Ab蛋白表達，tau蛋白磷酸化及炎癥因子如IL-1b等的表達。證實該藥物是通過抑制糖尿病代謝紊亂所引起的炎癥反應而淀粉樣前體的形成。WB結果顯示，藥物處理前后總tau蛋白并無變化，但神經(jīng)元內(nèi)斑塊標志物T231和S214磷酸化tau的磷酸化程度明顯降低，胞間斑塊標志物PHD指形蛋白1（PHF-1）的磷酸化也明顯降低。
5、標簽抗體的靈活運用
生物學研究已開發(fā)出許多標簽蛋白，如FLAG、His、GST、c-Myc、SUMO、GFP熒光蛋白等，它們極大地方便了蛋白的表達、純化、示蹤及定性、定量的多項研究。利用標簽抗體的優(yōu)勢有：
同一標簽抗體研究不同的融合蛋白；
融合蛋白可用anti-靶點抗體和anti-標簽抗體雙重鑒定；
GFP標簽即可用于IF/ICC檢測，又可用于WB等檢測；
標簽（如FLAG、HA）抗體用于融合蛋白的IP或co-IP較ProA/G偶聯(lián)方便快捷。
標簽抗體常用于Western Blot實驗中：
重組或敲除細胞系的鑒定；
融合蛋白表達量的差異；
在目標蛋白的不同位置加標簽，再通過相應的標簽抗體檢測來實現(xiàn)對蛋白功能區(qū)的劃分和鑒定。
案例Ⅰ
Radics等在脂膜上設計了精巧的針形通道，模擬在細菌膜上的3型分泌系統(tǒng)（注射體，”injectisomes”），研究注射體的結構及工作原理。作者通過設計目標蛋白SptP(WT)及其FLAG和GFP標簽融合蛋白，F(xiàn)LAG標簽可用于示蹤蛋白在胞內(nèi)和胞外的分布。由于帶有GFP標簽的融合蛋白不能通過該通道，GFP標簽起到了使SptP形成蛋白-通道復合體的作用，可用冷凍電鏡解析復合體的結構。利用金標抗GFP抗體可在電鏡下顯示復合體的形成。
案例Ⅱ
本文利用標簽蛋白研究蛋白的功能區(qū)。Yang等在研究單純皰疹病毒（HSV）出芽復合體的形成機制時，設想病毒蛋白pUL31的C端25個Aa對于其結合衣殼蛋白及核蛋白形成核出芽復合體（NEC）非常重要，于是設計帶有HA標簽的pUL31蛋白31HA，缺少C端25個Aa的31HA/560S，以及缺少pUL25區(qū)的31HA/25 null，發(fā)現(xiàn)pUL31及缺少pUL25的pUL31可以結合衣殼蛋白，但缺少C端25個Aa的31HA/560S不能結合。利用金標記HA抗體可在電鏡下觀察到衣殼蛋白頂端與pUL31形成復合體的情形。
