本期導(dǎo)讀:樣本的制備是IHC實驗成功的前提條件。樣本完成石蠟包埋后,需要成約3-4um的薄片。本文主要介紹了切片小技巧及過程中容易出現(xiàn)的16種問題(點擊獲取全部列表)進行了一一分析。
切片小技巧
① 組織切片,舊刀修片,新刀切片。
②切片厚度3-4μm(淋巴結(jié)、扁桃體、鼻咽、扁桃體2-3μm;脂肪5-6μm)
③切片毛筆應(yīng)順著刀背往刀鋒掃。
④切片動作輕,用力均勻。
⑤室溫、冷凍等溫度要適宜,易于切出薄片。
⑥刀片鋒利,切片角度5°最佳,切片平整無褶皺和收縮。
⑦切片方向:纖維、肌肉走向與切片平行;原則為軟→硬,易→難,主→次。
⑧蠟塊表面有鈣點,應(yīng)20%HCL表面泡1-2h,水洗后切。
⑨切片人員應(yīng)細(xì)心操作,防劃傷,切后維護保養(yǎng)機器。
?切片光面朝下展片、撈片。
?避免切片被污染。
?攤片水溫利于展平又不熔化,必要時用20%酒精攤片。
?用鑷子輔助將組織貼在玻片合適的位置。
?細(xì)小組織(穿刺、內(nèi)鏡小標(biāo)本)可以多貼幾個。
?玻片干凈,防止脫片(血塊、腦組織、脂肪)。
?在烘烤切片前應(yīng)做好排水,烤片溫度高于石蠟熔點5-10℃。
切片常見的16種問題及解決方法
問題1 細(xì)胞皺縮和收縮;核“起泡”變大損傷;膠原染色嗜堿性
原因:石蠟溫度過高。解決方法:烤箱溫度高于石蠟熔點5-10℃為佳。
問題2 切片卷成致密團
原因:①刀鈍;②傾斜角太?。虎矍衅?。解決方法:①換新刀片;②如果間隙角充分,降低傾刀的斜度。
問題3 切片破碎或切不成片
原因:①組織固定、脫水、透明不徹底,浸蠟不透;②浸蠟包埋溫度過高或時間過久。解決方法:①優(yōu)化組織處理;②及時更換試劑;③重新脫水補救;或者重取。
問題4 過分的壓縮
原因:①刀片鈍;②組織或石蠟過軟;③用力太猛,速度太快。
解決方法:①換刀片,移刀鋒;②使組織表面變冷,重新切??;③動作輕,用力均勻。
問題5 切片不成連片
原因:①刀刃不鋒利,刀間隙角度大;②蠟塊內(nèi)組織上下端留蠟邊太少或不整齊,刀邊碎片;③室溫過低或石蠟過硬。
解決方法:①移動刀口或更換刀片,檢查刀的角度,清潔刀片和刀架背面;②在低熔點的石蠟中重新包埋;③提高室內(nèi)溫度或溫暖蠟塊表面(哈氣等);④切片厚度適宜(根據(jù)組織類型)。
問題6 切片易粘附與組織塊
原因:①間隙角不足;②室溫過高或包埋石蠟熔點低;③刀片、組織塊邊緣的碎片;④組織帶靜電。解決方法:①增加間隙角;②清潔刀邊;③修剪組織塊的邊緣;④濕潤切片機周圍的空氣,地上灑水,開啟加濕器;⑤放置靜電防護器或切片機附近放置干燥板。
問題7 切片條帶彎曲不直
原因:①蠟塊上下兩面不平行;②蠟塊下邊與刀口不平行;③切片處刀鋒不一致;④組織本身硬度不一致。解決方法:①重新修整蠟塊,使上下兩邊平行;②將蠟塊移正,與刀口保持平行;③移動刀片或更換刀片;④修去組織較軟側(cè)的蠟塊。
問題8 蠟塊組織脫落
原因:①在粗修蠟塊時,先放組織后放蠟,否則組織與包埋蠟塊黏貼不牢;②蠟塊凍時間過長,切片時易出現(xiàn)蠟塊脫落現(xiàn)象。解決方法:①包埋先放石蠟后放組織,速度盡可能快;②切片動作小、勻速。
問題9 組織切片不完整,缺損
原因:①取材時未取中病灶,組織塊太大,太厚;②多塊組織包埋是排列不佳;③組織塊內(nèi)組織不平坦;④組織包埋方向失誤;⑤切片時粗修過多(切削過深)或過少(沒切到足夠的深度)。解決方法:①組織太大,脫水 不好,取材厚度3mm為佳;②組織在包埋模中均勻鋪平;③熟悉各種組織的切片特點,避免包埋方向的失誤(囊壁、管腔豎直包埋);④切片方向:軟到硬,易到難,主到次。
問題10 切片過厚
原因:①切片機維護不當(dāng),切片厚度設(shè)置錯誤;②石蠟太軟(熔點低);③石蠟過熱;④刀鈍。解決方法:①降低切片厚度設(shè)置;②定期校準(zhǔn)和保養(yǎng);③使用適合組織類型和密度熔點的石蠟;④常規(guī)病理組織切片厚度在3-4μm,淋巴結(jié)、脾臟、胸腺、鼻咽組織等含巴細(xì)胞成分較多的組織,薄切2-3μm,脂肪5-6μm。
問題11 切片縱裂,損傷,刀痕
原因:①組織中鈣化點、釘、縫合線或紙屑等異物;②刀片缺口;3刀口不潔,含有毛屑、碎組織、皮棉或石蠟等;④石蠟中有雜質(zhì)。解決方法:①更換刀片或移動刀口;②使用面脫鈣方法(20%HCl);③仔細(xì)清潔刀刃以除去多余的石蠟堆積;④如果石蠟中有異物,用干凈的石蠟重新包埋。
問題12 切片厚薄不均勻/跳刀/百葉窗/搓衣板
原因:①組織脫水過度;②切片刀不鋒利,刀間隙角(或傾斜度)太大;③切片速度太快④切片機部件松動或磨損;⑤組織致密或堅實;⑥主軸伸出太長。
解決方法:①處理過程中減少脫水時間;②更換刀片,減少傾斜度;③哈氣;④均速慢切;⑤確保刀和組織的有關(guān)螺絲擰緊夾牢;⑥主軸搖回復(fù)原。
問題13 褶皺/折疊
原因:①攤片溫度不合適,組織未充分伸展;②刀片不鋒利,刀角度大;③石蠟熔點低,過軟或室溫較高;④組織缺乏一致性。解決方法:①調(diào)小刀角度,邊切邊向蠟塊吹氣用10-20%酒精攤片,利用濃度差,水的張力來展片;②檢查攤片水溫,太冷不易展開;太熱會產(chǎn)生褶皺或折疊,組織細(xì)胞散開;③更換刀片或移動刀口;④切片厚度是否合適。
問題14 切片裂縫/碎裂
原因:①組織固定和處理不完全,攤片是發(fā)生裂解;②攤片水溫過高,攤片時間長導(dǎo)致過度延伸;③攤片時鑷子撐開過大;④烤片前切片排水不凈。解決方法:①確保固定和處理完全;②在攤片時輕輕延伸蠟帶,去除褶皺和折疊;③降低攤片水溫(通常低于包埋蠟熔點的5-10℃);④在切片和漂片過程中,小心操作蠟帶;⑤在烘烤切片前應(yīng)很好的排水。
問題15 柵狀裂和龜裂
原因:①固定、透明、浸蠟不充分;②攤片水溫過高;③過度脫水,去除了蛋白質(zhì)結(jié)合的水,組織發(fā)脆,當(dāng)漂浮在水面上是可能會裂開;④切片過程中過度冷凍。解決方法:①優(yōu)化組織脫水過程;②降低攤片水溫;③切片過程中勿使用冷卻噴霧劑,細(xì)胞易縮??;④勻速慢切,邊切邊對蠟塊吹氣。
問題16 切片中有氣泡
原因:撈片時切片下面有氣泡。解決方法:①保持溫水干凈,無雜質(zhì);②切片要干凈無污染;③撈片前將組織下的氣泡趕走。