細(xì)胞在各自正常分化成熟的不同階段以及活化過程中，其細(xì)胞膜表面均可表達供鑒別的特殊結(jié)構(gòu)，即表面標(biāo)志。流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞表面分子的檢測與分析主要應(yīng)用于免疫細(xì)胞及其亞群的檢測與功能分析；血液系統(tǒng)細(xì)胞表面標(biāo)志的研究；細(xì)胞群體及細(xì)胞表面標(biāo)志變化的檢測；細(xì)胞表面標(biāo)志構(gòu)成性質(zhì)分析。
細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析確定某些細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子或蛋白表達水平。分析細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)抗原的關(guān)鍵在于熒光標(biāo)記的抗體能自由進入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，且不能破壞細(xì)胞形態(tài)的完整性和保持細(xì)胞內(nèi)靶抗原不變。因此細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)染色的關(guān)鍵在于細(xì)胞固定和胞膜或核膜穿透。
抗原分布位置：
細(xì)胞表面抗原：CD分子、趨化因子、整合素、細(xì)胞因子受體、Fc受體
細(xì)胞內(nèi)抗原：細(xì)胞因子等
細(xì)胞核內(nèi)抗原：增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)等
流式操作流程
抗體標(biāo)記方法
1.直接標(biāo)記法：在一定量細(xì)胞懸液中，直接加入連接有熒光素的抗體進行免疫標(biāo)記反應(yīng)，加入緩沖液洗滌后，上機檢測抗體熒光。
2.間接標(biāo)記：在一定量細(xì)胞懸液中，先加入特異的第一抗體（純化后的無熒光抗體），待反應(yīng)完全后洗去未結(jié)合抗體，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體，生成抗原—抗體—抗抗體復(fù)合物，上機檢測其上標(biāo)記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的熒光。此方法中的熒光來源于二抗。
直接標(biāo)記與間接標(biāo)記比較
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比較項目 |
直接標(biāo)記法 | 間接標(biāo)記法 |
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標(biāo)記步驟 |
一步 | 兩步 |
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抗體 |
熒光素偶聯(lián)抗體 | 生物素偶聯(lián)抗體、熒光素偶聯(lián)SA |
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應(yīng)用 |
常用 | 多通道分析要求通道搭配時 |
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優(yōu)點 |
方法簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，易于分析， 多指標(biāo)共標(biāo)記（非特異性染色少）， 多用于臨床標(biāo)本的檢測 |
放大熒光信號、節(jié)約抗體種類， 多用于科研標(biāo)本的檢測 |
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缺點 |
成本較高 |
步棸多，細(xì)胞易丟失，二抗一般為多克隆抗體， 特異性較差，非特異性熒光背景較強，易影響實驗結(jié)果。 |
※點擊下載流式實驗解決方案
※點擊下載Bioss信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方向抗體（此表格僅展示Bioss可用于流式抗體產(chǎn)品的名稱與編號，每種抗體都有以下熒光標(biāo)記產(chǎn)品Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、AP、APC、Biotin、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、PE、PE-Cy3、PE-CY5、PE-CY5.5、PE-CY7）
