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文獻(xiàn)解讀｜實例分析體外培養(yǎng)類器官的全面檢測與評估

發(fā)表者：北京博奧森生物發(fā)表時間：2019-7-22

引文

過去幾年里，“類器官”(organoids) 這個名詞開始逐漸興起，大家可能聽說過它的名字。類器官(organoid) 是能夠在實驗室中利用人的干細(xì)胞培養(yǎng)出的微型器官，與來源組織和器官高度相似。類器官可以說是神奇的“多面手”，它既能夠讓我們更好地理解機(jī)體的發(fā)育過程，同時被作為疾病模型協(xié)助新藥研發(fā)，幫助我們治愈疾病。當(dāng)然，科學(xué)家也期待著能夠利用類器官替換病人體內(nèi)受損的組織，用于再生醫(yī)學(xué)。

正文

最近的一篇發(fā)表在Nature Methods的報道，采用了一種在毫米流控芯片上（流式培養(yǎng)）體外培養(yǎng)腎器官的方法，該方法擴(kuò)大了內(nèi)皮祖細(xì)胞的內(nèi)源性集群，并通過管壁細(xì)胞所包圍的可灌注腔生成血管網(wǎng)絡(luò)。為了評估不同培養(yǎng)方式得到的類器官在某一方面的性狀和生理功能，常常需要對類器官的各種發(fā)育與細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。在這篇報道中，研究人員發(fā)現(xiàn)具有粘附作用的胞外基質(zhì)（ECM）比不具有粘附作用的ECM為類器官中的血管發(fā)生提供了更好的培養(yǎng)條件，從血管發(fā)生相關(guān)標(biāo)志物MCAM、PECAM1以及PODXL的染色情況可以明顯觀察到兩者的效應(yīng)差異（圖1b）。為了評估流式培養(yǎng)腎臟類器官的血管形成情況，研究人員繼續(xù)觀察了在高流體剪切力（FSS）下體外培養(yǎng)的細(xì)胞器中MCAM和PECAM 1血管網(wǎng)絡(luò)在灌注10d后(即分化第21天)中的增強形成（圖1 c~e），并隨著時間的推移形成了新的腎單位（圖1 i~l），提示FSS是促進(jìn)體外培養(yǎng)腎臟類器官的血管生成的環(huán)境因素。

圖1：在高流體流動下體外培養(yǎng)的腎器官在腎發(fā)生過程中表現(xiàn)出增強的血管形成作用。a. 在毫米流控芯片內(nèi)的工程化的ECM上進(jìn)行受控于FSS的腎臟類器官的體外培養(yǎng)。分化天數(shù)和培養(yǎng)在面板的中部和底部指示條件。未按比例繪制的器官ID。b.對在粘附性或非粘附性ECM上培養(yǎng)的類器官的DNA、MCAM、Pectam1和Podxl等標(biāo)志物進(jìn)行染色。比例尺，100μm。c~h. 高FSS下培養(yǎng)的整個器官免疫染色（c~e）和相差顯微結(jié)果（f~h）的對比圖像（第12-21天）。比例尺：50μm（c~e）或300μm（f~h），灌注方從左至右。i~l，在靜態(tài)U井、靜態(tài)工程化ECM、低FSS和高FSS條件下培養(yǎng)的類器官整體血管標(biāo)記的共聚焦3D渲染。比例尺，100μm。m. 血管系統(tǒng)的豐度和特征的統(tǒng)計結(jié)果，報告為相對于U井培養(yǎng)條件下各個參數(shù)的倍數(shù)變化。 n. 在各種生長條件下PECAM1表達(dá)的定量PCR分析結(jié)果。

在高FSS情況下，PDGFRβ表達(dá)上調(diào)(圖2e)，其中PDGFRβ周細(xì)胞樣細(xì)胞向PECAM 1⁺網(wǎng)絡(luò)的募集與血管成熟一致(圖2F)。當(dāng)這些腎器官內(nèi)的血管在體外進(jìn)化時，研究人員注意到血管前體和成熟標(biāo)記物的異質(zhì)表達(dá)，包括灌注10d后的MCAM單陽性、PECAM 1單陽性或MCAM和PECAM 1雙陽性區(qū)域(分化第21天) (圖2g)。研究人員觀察到無核的開放圓形結(jié)構(gòu) (DAPI染色陰性)，并被MCAM陽性和PECAM 1陽性區(qū)域包圍，這些區(qū)域指示不同直徑的器官腔，反映多尺度血管的形成(圖2h)。值得注意的是，研究人員觀察到暴露于高FSS人多能干細(xì)胞 (hPSC) 衍生的腎臟器官 (圖2i，j)具有和14.5日齡小鼠腎臟的類似結(jié)構(gòu)(E14.5；圖2K)。為了確定全腎器官中可灌注血管的程度，研究人員先在培養(yǎng)基中注入幾個小時的熒光微珠(beads)，然后在嵌入ECM的細(xì)胞器上獲得實時共聚焦圖像(z-軸堆積)。這些器官隨后固定，對PECAM 1進(jìn)行免疫染色，并與其他標(biāo)記共染。研究人員觀察到熒光微珠出現(xiàn)在與更大的PECAM 1血管相一致的位置(圖2 l，m)。

圖2：在體外培養(yǎng)的腎組織中，觀察到細(xì)胞器內(nèi)和細(xì)胞器間血管網(wǎng)有壁細(xì)胞支撐的可灌注腔。a. 腎內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)育過程中的成熟圖，從祖細(xì)胞到持續(xù)的終末標(biāo)記表達(dá)。b. 培養(yǎng)第21天分離的整個類器官的流式細(xì)胞分析。EPC為FLK 1陽性細(xì)胞群。c.d. 培養(yǎng)第21天內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的定量PCR分析結(jié)果。e. 在第21天發(fā)育器官中PDGFRβ的定量PCR分析結(jié)果。 f. PODXL、PECAM 1和PDGFRβ在高FSS下的免疫染色。比例尺，15μM. g. 內(nèi)血管標(biāo)記的類器官整體共聚焦三維染色。比例尺，30μM。白色箭頭突出顯示的區(qū)域是PECAM1⁺MCAM^-。h. 圖g中的一個z軸圖像切片，其中白色箭頭突出顯示打開的管腔。比例尺，30μM. I~k，透射電鏡圖像顯示在高FSS(I，j) 和E14.5小鼠胚胎腎臟(k)下，由一層薄膜包裹的圓形開口，反映腎臟器官的血管腔。紅色加號顯示血管腔。比例尺，10μm (i，k) 或2μm(J)。l，m，在高FSS下培養(yǎng)的腎臟細(xì)胞器底部的z軸圖像切片，顯示血管網(wǎng)(l)和熒光微珠在血管網(wǎng)(m)內(nèi)的積聚。比例尺，100μM。n. 共聚焦3D染色顯示橋接的兩個相鄰的類器官(由虛線白線勾勒)。

研究人員還利用多重血管發(fā)生標(biāo)記物抗體進(jìn)行免疫熒光染色結(jié)合3D共聚焦成像觀察體外形成的腎小管極性增強，管狀上皮在流動條件下表現(xiàn)出明顯的成熟，并經(jīng)過形態(tài)發(fā)生，在芯片上的高流量條件下，成為與血管接觸的極化纖毛區(qū)室（結(jié)果未出示）。并且流式培養(yǎng)的腎臟類器官增強重現(xiàn)了在體內(nèi)的腎小球發(fā)育早期階段的腎小球血管形成和形態(tài)發(fā)生（結(jié)果未出示）。

總而言之，利用發(fā)育和細(xì)胞分化標(biāo)志物抗體進(jìn)行免疫染色并結(jié)合多種共聚焦染色技術(shù)（如全器官的3D共聚焦染色）對于對類器官的各項進(jìn)行功能鑒定，是類器官研究的一項重要支撐技術(shù)平臺，極大地提升了對于類器官發(fā)育和功能的分析精度，可以更好地幫助研究人員評估類器官培養(yǎng)方式的有效性。

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