最近，Bioss直標(biāo)一抗促銷活動正如火如荼進(jìn)行，其中有相當(dāng)大一部分直標(biāo)抗體屬于熒光標(biāo)記抗體。為了幫助大家更好地使用熒光直標(biāo)一抗，我們特地準(zhǔn)備了這個小短文，供您參考。
對于熒光直標(biāo)一抗，需要注意以下四點：
01
1.選擇熒光標(biāo)記要匹配熒光直標(biāo)抗體的一個主要優(yōu)勢在于它為多重檢測提供了機(jī)會，比如現(xiàn)在一些先進(jìn)的流式細(xì)胞儀能檢測每個細(xì)胞中20多個離散參數(shù)。在設(shè)計多重實驗時，應(yīng)考慮每種熒光基團(tuán)的獨(dú)特性質(zhì)，如最大吸收波長和最大發(fā)射波長，消光系數(shù)和斯托克斯位移等因素。
對于免疫熒光分析方法，人們要同時檢測組織或細(xì)胞樣本中的多個抗原，常常會利用直標(biāo)一抗進(jìn)行免疫熒光共染色，這時一般盡量選擇光譜重疊比較少的熒光基團(tuán)進(jìn)行組合。比如，我們會選擇一個AF488標(biāo)記的抗體和另一個AF647標(biāo)記的抗體進(jìn)行兩個不同蛋白的共染色。
對于流式細(xì)胞分析方法，我們對同時檢測多個抗原所需的熒光抗體的選擇相對容易一些。由于在流式細(xì)胞實驗過程中，熒光抗體對單細(xì)胞懸液的標(biāo)記效果直接影響實驗的數(shù)據(jù)質(zhì)量。因此，需要考慮各種影響流式抗體品質(zhì)及檢測效果的因素，例如抗體特異性、熒光素信號強(qiáng)弱、熒光素標(biāo)記方式、同型對照等。首先，選擇流式熒光抗體一定要滿足最基本的條件：抗體有較好的目標(biāo)蛋白特異性及適用的反應(yīng)種屬。其次，要根據(jù)目標(biāo)蛋白的豐度，選擇匹配的熒光素，來保證合適的熒光強(qiáng)度。如不同熒光標(biāo)記在不同的儀器上強(qiáng)度不同，以FACS Calibur儀器為例：PE>APC>PE-Cy5>PerCP>FITC>PerCP-Cy5.5。通常來說，PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原。FITC強(qiáng)度較弱，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原，使用范圍比較廣。用戶需根據(jù)檢測的目標(biāo)蛋白進(jìn)行具體選擇。如果同時檢測多個指標(biāo)：確認(rèn)流式細(xì)胞儀能檢測多少個通道：流式抗體每個通道只能選擇1種熒光素。各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。如：實驗者同時檢測三個指標(biāo)，可以在下圖中綠色、黃色和紅色三個通道中各選一個適當(dāng)?shù)臒晒馑貥?biāo)記，F(xiàn)ITC、PE和PE-cy5。切忌所有指標(biāo)選擇同一個通道的熒光標(biāo)記，以防止熒光的重疊和相互干擾，影響最后結(jié)果。因此，流式細(xì)胞儀的通道越多，同一份樣本能同時做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多。常用熒光標(biāo)記包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。我們這邊提供如下表格，幫助大家進(jìn)行熒光素的選擇。
2.熒光試劑保存要妥當(dāng)
盡管許多熒光基團(tuán)具有相對的光穩(wěn)定性，但在保存和染色過程中若未能避光,則可能導(dǎo)致熒光基團(tuán)-抗體結(jié)合物降解，引起假陰性結(jié)果。熒光物質(zhì)必須在建議溫度下小心保存，并始終注意避光，以保護(hù)其光譜完整性。另外，串聯(lián)的熒光基團(tuán)（如PE-Cy5）對頻繁操作引起的不穩(wěn)定性特別敏感，大家要注意。
3.操作方案要優(yōu)化
1.免疫熒光操作方案的優(yōu)化
對于免疫熒光實驗，從細(xì)胞樣品處理、固定、通透、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實驗流程中每個步驟的質(zhì)量，才能最終達(dá)到你的實驗?zāi)康?。樣品制備（通俗的說法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實驗的第一步，其質(zhì)量對實驗的成敗至關(guān)重要，這一步關(guān)鍵的是玻片的處理以及細(xì)胞的活力。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實驗結(jié)果是非常重要的。封閉最好用與指標(biāo)一抗相同來源種屬的正常血清來進(jìn)行封閉。對于直標(biāo)一抗的免疫熒光染色，我們需要考慮抗體的建議稀釋度，以實現(xiàn)高的信噪比。若抗體濃度過低，則熒光信號較弱，可能難以與背景區(qū)分開，但抗體濃度過高，則會導(dǎo)致較高的背景染色。另外，要注意各步驟之間的徹底洗滌的重要性，利用生理溶液來洗滌，可去除未結(jié)合的熒光試劑，或那些只是粘在目標(biāo)上而非特異性結(jié)合的熒光試劑，從而提高信噪比。最后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結(jié)果。盡管免疫熒光技術(shù)提供了準(zhǔn)確的結(jié)果，但也存在一些缺點，包括自發(fā)熒光、熒光信號的淬滅。因此，可以針對上述問題，利用一些免疫熒光專用細(xì)胞處理試劑去進(jìn)行預(yù)處理，以減少自發(fā)熒光或熒光信號的淬滅。有關(guān)免疫熒光技術(shù)的詳細(xì)講解，可以通過點擊我們近期發(fā)布的其他軟文來查看詳情。
2.流式細(xì)胞術(shù)操作方案的優(yōu)化
流式細(xì)胞術(shù)操作方案的優(yōu)化，主要包括以下幾個方面：
選擇固定劑
（1）變性試劑：通過將蛋白變性再固定在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的有機(jī)溶劑，如90%甲醇、70%乙醇等，變性試劑一般與細(xì)胞膜磷脂雙分子層有相互作用，因此同時具有破膜作用。如果采用變性試劑固定細(xì)胞，而抗體用來標(biāo)記胞內(nèi)蛋白，則不需要另外破膜。
（2）交聯(lián)試劑：通過自由氨基基團(tuán)使蛋白分子交聯(lián)起來固定蛋白，如4%多聚甲醛、10%福爾馬林溶液等，如果采用交聯(lián)試劑固定細(xì)胞，而抗體用來標(biāo)記胞內(nèi)蛋白，則需要另外破膜。
優(yōu)化抗體使用濃度
抗體滴定方法：用同種細(xì)胞，相同細(xì)胞數(shù)量與反應(yīng)體積，加入不同量的抗體計算陽性峰熒光強(qiáng)度及信噪比（S/N>3）。
（1）滴定的濃度范圍盡量大，至少5個左右。
（2）滴定實驗條件要和實際實驗條件一致，如反應(yīng)溫度、pH等。
（3）弱表達(dá)或不分群的抗原不適合做滴定。
封閉Fc受體
Fc受體是指細(xì)胞表面能夠與免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM、IgE和IgD）結(jié)合的分子，存在于NK 細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的表面。FcR 能夠與抗體的Fc段結(jié)合，在檢測時產(chǎn)生假陽性。
（1）商品化的 Fc Block試劑：重組人 IgG，小鼠 CD16/CD32 抗體。
（2）人血清或相應(yīng)物種的血清
排除死細(xì)胞
死細(xì)胞的自發(fā)熒光水平很高，且容易攝取抗體導(dǎo)致非特異性結(jié)合，最終影響實驗結(jié)果； 還可能會釋放DNA，DNA非常粘稠，會導(dǎo)致細(xì)胞成團(tuán)，容易堵塞管路。
區(qū)分死細(xì)胞的方法
死細(xì)胞特性：細(xì)胞膜滲透性增強(qiáng)，失去膜完整性
（1）DNA結(jié)合染料：PI、DAPI、7-AAD、TO-PRO-3等DNA染料只會進(jìn)入細(xì)胞膜受損的細(xì)胞，結(jié)合到細(xì)胞的DNA上,圖三門R3中為7-AAD陰性，即為活細(xì)胞。
（2）蛋白結(jié)合染料：結(jié)合細(xì)胞表面或膜內(nèi)的游離胺，活細(xì)胞弱陽，死細(xì)胞強(qiáng)陽?？梢杂迷诠潭?biāo)本中的，區(qū)分樣本固定細(xì)胞狀態(tài)。
4.要設(shè)立必要的對照
對于免疫熒光或流式細(xì)胞分析實驗，由于操作步驟比較多，同時在分析結(jié)果時無法像WB那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識別，所以要得到一個可信的實驗結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對實驗條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化外，還必須設(shè)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒瀸φ?。對于熒光直?biāo)抗體，我們建議使用抗體的同型對照，即與抗體同一個來源種屬的正常同型IgG作為對照，對樣品進(jìn)行平行染色，來確定抗體的染色是否特異。此外，我們還可以使用不表達(dá)目標(biāo)的細(xì)胞或組織作為陰性樣品對照。同時，為了確保所有組分都正常發(fā)揮作用，那些已知表達(dá)目標(biāo)的陽性對照也少不了。
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精選主題產(chǎn)品列表
代謝與心血管疾病(Metabolism and Cardiovascular Diseases)
神經(jīng)科學(xué)和神經(jīng)退化(Neuroscience and Neurodegeneration)
胚胎干細(xì)胞與發(fā)育(Epigenetics, Stem Cell and Development)
多研究領(lǐng)域(Multiple Research Areas)
活動內(nèi)容：
訂貨前：
1. 先試用再購買，100個名額，先到先得。
2. 反饋試用結(jié)果，獎勵驚喜禮包一份。
訂貨后：
1. 訂購2支以上100ul活動內(nèi)抗體送100元京東卡一張。
2. 反饋實驗結(jié)果，獎勵驚喜禮包一份。
活動時間：2019年7月15日至2019年10月31日。
活動規(guī)則：4. Bioss樣本庫樣本與研究者樣本一致，即可在3個工作日內(nèi)發(fā)貨，寄送樣本者需等待7-10個工作日。
5. 細(xì)胞樣本僅接受北京地區(qū)寄送，組織樣本接受全國寄送，不接受到付樣本。
6. 寄到Bioss要求匹配驗證的樣本不予寄回, 請客戶填寫清楚實驗信息。
活動申請表單鏈接：
直標(biāo)一抗試用裝申請表單
直標(biāo)一抗試用裝反饋表單
以上活動最終解釋權(quán)歸Bioss所有！
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