一、蛋白免疫印跡(Western Blot)技術(shù)概覽
蛋白免疫印跡(Western Blot，以下簡稱WB)是利用特定抗體能夠?qū)Ｒ唤Y(jié)合其抗原“蛋白質(zhì)”的原理來對樣品進(jìn)行著色，通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)或修飾水平的免疫檢測技術(shù)。
一般我們使用WB 都是為了半定量檢測某種目的蛋白的相對表達(dá)量，通常要以表達(dá)相對穩(wěn)定的蛋白作為內(nèi)部對照（內(nèi)參），然后采用“灰度分析軟件”檢測目的蛋白及內(nèi)參條帶的表達(dá)強(qiáng)度，每組目的蛋白分別以內(nèi)參作為對照進(jìn)行比對和相對定量，以使實驗結(jié)果更加準(zhǔn)確。同時，同一批樣品至少進(jìn)行技術(shù)重復(fù)三次，然后方可進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。WB靈敏度可達(dá)ng級，用ECL顯色法理論上可達(dá)pg級。
二、蛋白免疫印跡(WB)實驗所需儀器、材料及試劑
（一）主要實驗儀器
制冰機(jī)、超聲破碎儀、低溫冷凍離心機(jī)、蛋白電泳/轉(zhuǎn)膜儀、多功能酶標(biāo)儀、LI-COR Odyssey成像系統(tǒng)
（二）主要實驗試劑與材料
15ml離心管、玻璃組織研磨器、EP管、冰浴、蛋白抽提試劑(改進(jìn)型RIPA配方，Bioss產(chǎn)品貨號C05-01001)、蛋白酶抑制劑混合物(protease inhibitor cocktail)、BCA蛋白定量試劑盒(Bioss產(chǎn)品貨號C05-02001)、30%丙烯酰胺-N ,N-亞甲基雙丙烯酰胺混合液(29:1)(Bioss產(chǎn)品貨號C05-03004)、10%過硫酸銨(APS)(Bioss產(chǎn)品貨號C05-03009)、四甲基乙二胺(TEMED)(Bioss產(chǎn)品貨號C05-03008)、4×蛋白上樣緩沖液(Bioss產(chǎn)品貨號C05-03015)、蛋白Marker(Bioss產(chǎn)品貨號C05-090006)、電泳緩沖液(Bioss產(chǎn)品貨號C05-03010)、轉(zhuǎn)膜緩沖液(Bioss產(chǎn)品貨號C05-05003)、考馬斯亮藍(lán)染色液(Bioss產(chǎn)品貨號C05-04001)、TBST緩沖液(pH7.4)(Bioss產(chǎn)品貨號C5049)、PVDF膜(Bioss產(chǎn)品貨號C55008)或NC膜(0.22μm)(Bioss產(chǎn)品貨號C05-05002)、麗春紅染色液(Bioss產(chǎn)品貨號C05-04002)、脫脂奶粉(Bioss產(chǎn)品貨號C5059)、牛血清白蛋白(BSA)、目的蛋白一抗、WB一抗稀釋液(Bioss產(chǎn)品貨號C05-07001)、HRP標(biāo)記二抗(bs-0295G-HRP或bs-0296G-HRP)或熒光標(biāo)記二抗(Bioss內(nèi)部操作流程選用熒光二抗，Bioss產(chǎn)品貨號bs-40295G-IRDye8或bs-40296G-IRDye8)、WB二抗稀釋液(Bioss產(chǎn)品貨號C05-07002)、ECL發(fā)光液(Bioss產(chǎn)品貨號C05-07004)、膜再生液(Bioss產(chǎn)品貨號C05-03041)
Western Blot操作流程圖及Bioss相關(guān)配套試劑
三、蛋白免疫印跡(WB)實驗標(biāo)準(zhǔn)操作流程和技術(shù)要點
（一）蛋白提取
● 組織樣品蛋白提取方法
1. 用滅菌（預(yù)冷）的工具分離新鮮目的組織50mg-100mg，并用生理鹽水或PBS洗滌干凈，用潔凈的剪刀將組織剪碎至合適大小。
2. 將剪碎的組織轉(zhuǎn)移到玻璃研磨器中，加入適量的含有蛋白酶抑制劑（必要時還需要加入磷酸酶抑制劑）的RIPA（按照每20mg組織加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液），置于冰上研磨2-5min，直到看不到明顯的大的細(xì)胞團(tuán)塊，然后在冰浴裂解30min，讓組織細(xì)胞充分裂解；可取少量裂解后組織液滴于載玻片，蓋上蓋玻片進(jìn)行光鏡下觀察確認(rèn)是否裂解充分。
3. 注：RIPA裂解液有（中）和（強(qiáng)）裂解強(qiáng)度兩種，可以根據(jù)組織類型進(jìn)行調(diào)整，以提高裂解效率。
4. 超聲處理 10–15s，以完成細(xì)胞裂解并剪切 DNA，以降低樣品粘度和提升蛋白溶解度。
注意：為確保組織細(xì)胞充分裂解，建議進(jìn)行超聲破碎。調(diào)節(jié)超聲儀至適宜頻率與功率（超聲功率不宜過大，并設(shè)置超聲間歇，以防止超聲探頭過度產(chǎn)熱），將超聲探頭置于樣本裂解液中部，但不觸碰管壁或管底，進(jìn)行冰浴超聲。
超聲循環(huán)設(shè)置如下：
超聲3s，暫停10s，重復(fù)3-5次。
5. 超聲處理后將樣品繼續(xù)置于冰上孵育30min。
6. 將上述裂解后樣品，于4℃，12 000rpm，離心15-20min，取上清到一個新的EP管，置于冰上備用。
● 細(xì)胞樣品蛋白提取方法
1. 對于貼壁細(xì)胞：從培養(yǎng)物中吸出培養(yǎng)基，用 1× PBS 洗滌細(xì)胞后，加入含有蛋白酶抑制劑（必要時還要加入磷酸酶抑制劑）的RIPA裂解液（6 孔板每孔 100 μl 或 10 cm 直徑的平板 500 μl）來裂解細(xì)胞，然后立即從板上刮下細(xì)胞并將提取物轉(zhuǎn)移至EP管，置于冰上。
2. 對于懸浮細(xì)胞：將懸浮細(xì)胞連同培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管，室溫1000rpm離心5min，收集細(xì)胞沉淀，然后加入含有蛋白酶抑制劑（必要時還要加入磷酸酶抑制劑）的RIPA裂解液(6 孔板每孔100 μl 或 10 cm 直徑的平板 500 μl)，用加樣器吸打幾次后轉(zhuǎn)入一個新的EP管，置于冰上來裂解細(xì)胞。
3. 超聲處理 10–15s，以完成細(xì)胞裂解并剪切 DNA，以降低樣品粘度和提升蛋白溶解度。
注意：為確保組織細(xì)胞充分裂解，建議進(jìn)行超聲破碎。調(diào)節(jié)超聲儀至適宜頻率與功率（超聲功率不宜過大，并設(shè)置超聲間歇，以防止超聲探頭過度產(chǎn)熱），將超聲探頭置于樣本裂解液中部，但不觸碰管壁或管底，進(jìn)行冰浴超聲。
超聲循環(huán)設(shè)置如下：
超聲3s，暫停10s，重復(fù)3-5次。
4. 超聲處理后將樣品繼續(xù)置于冰上孵育30min。
5. 將上述裂解后樣品，于4℃，12 000rpm，離心15-20min，取上清到一個新的EP管，置于冰上備用。
（二）蛋白定量
1. 配制工作液: 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按體積比 A : B (50 : 1)配制適量 BCA 工作液，充分混勻。BCA 工作液室溫 24 小時內(nèi)穩(wěn)定。
2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取 10 微升標(biāo)準(zhǔn)品用 PBS 稀釋至 100ul（標(biāo)準(zhǔn)品一般可用 PBS 稀釋），使終濃度為 0.5mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品按 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20ul 加到 96 孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加 PBS 補(bǔ)足到 20ul。
3. 將稀釋后（一般稀釋5倍）的適當(dāng)體積樣品加入96 孔板的樣品孔中，補(bǔ)加 PBS 到 20ul。
4. 各孔加入 200ul BCA 工作液，37℃放置 30 分鐘。
5. 將96孔板冷卻到室溫，用酶標(biāo)儀 562nm 測定 OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度，理想的蛋白濃度應(yīng)為1-5 μg/μl。
注意：對于過高的樣品濃度，我們建議將樣品用RIPA裂解液進(jìn)行合理稀釋并充分混勻后，再進(jìn)行一次濃度測定為宜。
（三）電泳上樣樣品的制備
1. 在上樣前，建議用提取樣品用的RIPA裂解液將制備的組織、細(xì)胞蛋白樣品的濃度統(tǒng)一調(diào)整為相同濃度并充分混勻，最好都在3-5μg/μl。
2. 上樣量為20-40μg(如果是純蛋白，上樣量為100ng)，根據(jù)上樣量計算好體積，每管樣品分別與4×蛋白上樣緩沖液按體積比1:3混勻。
3. 煮沸5-10min，使樣品還原變性，然后立即放于冰上備用。
4. 對于剩余的樣品，可以統(tǒng)一加入4×蛋白上樣緩沖液后，將樣品在-20℃或-80℃保存。
（四）電泳
1. SDS-PAGE凝膠的制備
根據(jù)要檢測的目的蛋白分子量范圍，參考下表選擇合適的分離膠濃度灌制分離膠，加入保護(hù)層（可小心加入0.5ml去離子水封壓膠面）。待分離膠凝固后，倒出保護(hù)層的去離子水，再灌注濃縮膠。根據(jù)樣品數(shù)量和體積，選擇合適的梳子插入濃縮膠。待濃縮膠完全凝固后，小心拔出梳子，將凝膠放入電泳槽內(nèi)。
2. 蛋白上樣與電泳
將上述變性處理后的樣品低速短暫離心后，按照實驗設(shè)計的上樣順序，分別加入樣品孔中。最后，加入合適的預(yù)染蛋白Marker。濃縮膠恒壓80V，分離膠150V電壓條件下電泳，直至指示劑溴酚蘭遷移至凝膠底部。
電泳合格標(biāo)準(zhǔn)：目的蛋白條帶位于分離膠的中部，并且條帶充分分離。
（五）考馬斯亮藍(lán)染色（備選步驟）
在進(jìn)行正式實驗前，對于剛剛制備的蛋白樣品，可取少量上樣電泳后，把整張膠用考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行初步鑒定，以確定樣品的質(zhì)量。然后，再進(jìn)入正式實驗。
（六）蛋白轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)法）
原理：蛋白因結(jié)合SDS而帶負(fù)電荷，在電場中從膠轉(zhuǎn)移至膜上。
1. 將PVDF膜在無水甲醇中浸泡1-3min，再孵育于冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中5min。膠也可以在轉(zhuǎn)膜液中平衡3-5min，防止轉(zhuǎn)膜時條帶變形。
2. 制作轉(zhuǎn)膜“三明治”
濕式轉(zhuǎn)膜三明治排列順序：海綿/吸水紙/膠/膜/吸水紙/海綿，全部緊密排列，特別是膠與膜之間不能留有氣泡
三明治安裝的方向：負(fù)極與膠同側(cè)，向正極方（膜）遷移。
膜的面積：5.2 * 8.4 cm
濾紙的面積：4條邊均略長于膜的4條邊。，
3. 200-300mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間可參考下表。
（七）轉(zhuǎn)膜后蛋白染色（備選步驟）
將膜置于麗春紅工作液中，在室溫下?lián)u動1-5min，待蛋白帶顯示，后用TBST或超純水洗膜，直至洗凈膜上麗春紅。
（八）膜的封閉
封閉的作用：為避免作為檢測試劑的特異性一抗與膜發(fā)生非特異性結(jié)合而造成背景提高，需要對膜上的潛在非特異性結(jié)合位點進(jìn)行封閉處理。
封閉條件：用TBST溶解的5%的脫脂奶粉或5%的BSA（建議提前配制，使奶粉或BSA充分溶解），室溫封閉1h。
另外，需注意膜封閉的一些特殊情況：
● 脫脂奶粉成本低，但不能用于磷酸化蛋白檢測。因為脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，使用脫脂奶粉時，磷酸化抗體可能也會與奶粉中的磷酸化蛋白結(jié)合，從而產(chǎn)生高背景。
● 如果是生物素標(biāo)記的二抗就不宜用牛奶，因為牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。
● 某些抗體用BSA封閉時因不明原因也可能會產(chǎn)生比脫脂奶粉更強(qiáng)的信號，建議參照抗體說明書進(jìn)行實驗。
（九）一抗的孵育
1. 用WB專用一抗稀釋液(對整張膜建議使用5-10ml)，按一定比例(一般為1:1000-1:2000)稀釋一抗。
2. 倒掉封閉液，將膜置于適量一抗孵育液中，4℃，水平搖床孵育過夜。
3. 用TBST洗膜，3次，每次5min。
（十）二抗的孵育和洗膜
1. 用WB二抗稀釋液按一定比例(HRP標(biāo)記二抗稀釋1:5000-1:10 000；熒光二抗1:10000-1:20000)稀釋二抗。
2. 將膜置于二抗孵育液中，水平搖床室溫孵育1h。
3. 用TBST洗膜，3次，每次5min。
（十一）目的蛋白質(zhì)顯影
● 化學(xué)發(fā)光法（使用HRP偶聯(lián)的二抗）
1. 制備 ECL 工作液：A 液和 B 液等體積的混合，例如0.5ml A 液和0.5ml B 液混合，混勻后即可使用。
2. 用量以充分覆蓋印跡膜為準(zhǔn)，每10cm2 膜需要大約 1 ml 工作液。
3. 將印跡膜有蛋白的一面朝上平整的鋪在一張平板上，加上配好的發(fā)光底物工作液。
4. 將工作液均勻滴加在印跡膜上，孵育 1-5 min?？蓪⒁粷崈舻谋ｕr膜或透明的玻璃紙平整的鋪在孵育有工作液的印跡膜上，輕輕趕出其間的氣泡。
5. 用合適的照相器材直接記錄蛋白膜的化學(xué)發(fā)光圖或使用 X 射線膠片曝光（曝光 5 秒至 1 分鐘，通過調(diào)整 X 片的曝光時間獲得最佳結(jié)果）。
● 熒光底物法（使用熒光二抗）
1. 將膜上多余的 TBST 瀝干，可使其干燥。
2. 使用合適的熒光掃描儀(如LI-COR Odyssey 熒光成像系統(tǒng))，根據(jù)制造商的建議掃描膜上條帶。
四、蛋白免疫印跡(WB)實驗常見問題和解決方案
附表1：Bioss常見內(nèi)參抗體
附表2：Bioss常見蛋白免疫印跡(WB)配套試劑
*更多產(chǎn)品選擇，請訪問Bioss官方網(wǎng)站http://www.www.p2b3.cn/
