文章信息
期刊：American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine
影響因子(IF)：16.494
文章名稱：Is PKM2 Phosphorylation Prerequisite for Oligomer Disassembly in Pulmonary Arterial Hypertension?
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作者：Novoyatleva T等
作者單位：德國吉森大學
研究背景
肺動脈高壓（PAH）是一種不可治愈的血管疾病，由于肺部血管重構以及肺部血管阻力增加，最終導致右心衰竭甚至死亡（1）。PAH與癌癥的主要病理生理機制相同，包括大量的代謝重編程，使用糖酵解途徑取代線粒體的氧化磷酸化獲取能量（WarBurg效應）。丙酮酸激酶（PK）負責催化糖酵解途徑的最后一步反應，即將磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）上的磷酸根轉移到ADP上，從而產生丙酮酸（Pyruvate）和ATP。肌肉型丙酮酸激酶基因（PKM）選擇性剪接產生PKM1和PKM2兩種同工酶，PKM1在分化終末組織中產生組成型活性四聚體，PKM2在增殖細胞和腫瘤中形成高活性的四聚體以及低活性二聚體/單體（2）。多種變構效應物（如fructose-1,6-bisphosphate）及翻譯后修飾（Y105 及 S37的磷酸化）控制PKM2構象變化來變實現單體、二聚體和四聚體的動態(tài)平衡。PKM2從四聚體轉變成低活性二聚體/單體，最終將糖酵解途徑轉向生物合成途徑中，促進Warburg效應。因此，PKM2低聚反應是決定酶的最終活性的關鍵因素，造成代謝重編程。Erk1/2（由生長因子激活）依賴型磷酸化導致PKM2核轉運進而激活代謝基因的轉錄活性（3）。此外，核PKM2作為異鏈菌素（β-catenin）的共活化劑誘導細胞周期蛋白D1和c-myc（Cyclin D1和c-Myc）表達，突出PKM2對細胞周期進程的非代謝作用（4）。聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）信號通路調節(jié)核PKM2功能，在PAH發(fā)展中發(fā)揮著至關重要的作用（5，6）。
各種癌癥類型的血漿中二聚體PKM2含量均有提高（2），表明PKM2可作為代表細胞代謝活性和增殖能力的非器官特異性生物標記物。此外，最近的研究表明，在肺動脈高壓(PH)內皮細胞和成纖維細胞中，PKM2的代謝和增殖異常（7，8）。PH中PKM2的血漿水平及PAH中PKM2的表達、定位、磷酸化以及寡聚化程度在很大程度上仍然是未知的。
研究結果
為了研究循環(huán)PKM2是否是PH的標志物，作者分析了從Giessen肺高血壓登記處獲得的多種病因的患者血漿。（ethics approval no. 186/16,266/11）（9）。來自健康志愿者的外周血漿和來自平均肺動脈壓力<25mmHg（非PH）個體的中心靜脈血漿作為非PH對照。與健康對照（n=30）、非PH對照（n=31）和慢性血栓栓塞PH患者（IV組PH；n=38）相比，血漿中二聚體PKM2的水平在特發(fā)性PAH（IPAH；n=35）患者中顯著降低（圖1A）。受試者工作特征（ROC）分析以PKM2區(qū)分IPAH患者與非PH對照的可行性，結果顯示血漿PKM2與血流動力學參數、患者患病的嚴重程度和生存并無關聯性。
圖1. PH中PKM2的血漿水平、表達以及定位。 A、采用Tu-M2PK ELISA試劑盒測定健康志愿者外周血靜脈血和非PH值對照組和PH值患者中心靜脈血（右心導管術）中的PKM2水平。ROC曲線下面積為0.69。95%置信區(qū)間為0.56-0.81；P < 0.01。B、定量逆轉錄酶聚合酶鏈反應分析IPAH患者（n=9）與非PH對照組（n=5） PASMCs中PKM1和PKM2的mRNA表達。C、免疫組織化學和光學顯微鏡定量IPAH患者（n=12）和非PH對照組（n=11）肺組織中的PKM2。標尺為50um。D、免疫熒光檢測非PAH（非PH）志愿者或IPAH患者（每組3個受試者）肺部小肺動脈中PKM2（綠色）和SMA（紅色）（α-actin, 平滑肌細胞的特定標志）。細胞核用DAPI（藍色）染色。標尺：50μm。CTEPH：慢性血栓性肺動脈高壓；DAPI：4 6-diamidino-2-phenylindole；HPRT：[醫(yī)]次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶；IPAH：特發(fā)性肺動脈高壓；n.s.：不重要的；PKM2：丙酮酸激酶2；SMA：α-smooth肌肉肌動蛋白。
圖2. PKM2的磷酸化、低聚化和調節(jié)。A、WB檢測及定量分析PASMCs（非PH對照組，n=5；IPAH患者，n=8）中 phospho-PKM2和總PKM2。B、免疫熒光檢測及定量分析PASMCs中p-PKM2的免疫熒光染色和定量（phospho-PKM2[Tyr105]抗體，bs-3334R，Bioss）。C、WB檢測及定量分析非PH對照組（n=4）及IPAH患者（n=4）肺組織及PASMCs中PKM2寡聚化（在戊二醛[0.01%]交聯后）。D，WB檢測非PH對照組及IPAH患者細胞核和細胞質中phospho-PKM2和總PKM2（phospho-PKM2[TYR105]抗體bs-3334R，Bioss）。Lamin B1和α-tubulin分別作為細胞核及細胞質的內參蛋白。E.WB檢測及定量分析來自非PH對照組志愿者PASMCs（暴露在缺氧環(huán)境和PDGF-BB24小時后）細胞核中phospho-PKM2和總PKM2水平。F.核p-PKM2與CyclinE和PCNA的相關性分別為r=0.97，r=0.96，*P<0.05。在逐漸增加FBS含量培養(yǎng)條件下非PH對照組志愿者PASMCs細胞核中p-PKM 2，總PKM 2，Cyclin E和PCNA的WB檢測。G.通過免疫熒光定量檢測 Ki67陽性確定細胞增殖潛能，結果顯示IPAH患者肺組織PASMCs增殖潛能與四聚體比率無顯著相關性（r=-0.48）。P<0.05被認為具有統計學意義。Ki67抗體和肌動蛋白（SMA）α（α-actin，一種平滑肌細胞的特定標記物）。人PASMCs（傳代5～7）在37℃培養(yǎng)24h至80％。用于刺激研究的細胞用60mm培養(yǎng)皿（2×105/皿）中培養(yǎng)，用于低聚反應的細胞用100mm培養(yǎng)皿（4×105/皿）。 每個培養(yǎng)皿的細胞）。PDGF-BB和FBS刺激前，細胞先用血清饑餓法培養(yǎng)24小時。缺氧環(huán)境的細胞培養(yǎng)在37℃缺氧環(huán)境（5％CO2和1％O2）。
作者為了了解PKM2水平升高的潛在機制，將非PH對照組的PASMCs暴露于缺氧環(huán)境和血小板衍生生長因子BB（PDGF-BB），這兩種環(huán)境均可觸發(fā)PASMCs細胞增殖異常。缺氧環(huán)境和PDGF-BB均顯著提高PKM2 Y 105位點的磷酸化，而PDGF-BB進一步提高了核PKM2的絕對水平（圖2E）。核PKM2磷酸化水平高低與細胞周期G1/S期轉換的核標記物之間存在線性依賴性關系，PKM2升高與細胞增殖呈正相關（圖2F）。PAH患者SMCs的增殖潛能與PKM2低聚化存在明顯但非顯著相關性（圖2G）。PH研究中并沒有涉及過PKM2的低聚化或磷酸化狀態(tài)，本文關于PH內皮細胞和成纖維細胞中通過促進四聚體形成激活PKM2激活劑，逆轉糖酵解表型特征并減少不同的生物合成途徑的研究結果補充了這一空缺。磷酸化水平決定PKM2從高活性四聚體（葡萄糖氧化的重要因素）向低活性二聚體/單體（促進糖酵解）的轉變。因此，可通過磷酸化水平依賴型的PKM2表型變化來降低PH患者肺中PK活性。IPAH患者細胞中PKM2核轉錄并不能排除有其他可降低血漿PKM2水平的調節(jié)機制存在的可能性。因此，PAH中的代謝重編程不僅僅是由PKM2含量的絕對升高引起，還由其變構調節(jié)以及隨后的核定位引起（部分受磷酸化水平影響） 。然而，在PAH中，哪些起決定因素的分子/機制是導致PKM2二聚體分解為單體的生理機制，目前尚不清楚。
Bioss被引用產品
文中采用了Bioss公司的phospho-PKM2[TYR105]抗體（bs-3334R）對非PH對照組和IPAH患者細胞核和細胞質中p-PKM2水平，以及不同處理后非PH對照組PASMCs細胞核中p-PKM2水平進行WB檢測及定量分析，使作者順利完成了PKM2 Y105位點磷酸化水平改變酶的寡聚狀態(tài)，進而影響酶的活性的驗證。為作者進一步佐證Y105位點磷酸化可能促進PKM2核轉錄進而調節(jié)基因轉錄水平的觀點提供了支撐。
（感謝《Am J Respir Crit Care Med》提供素材！侵刪?。?/span>
Bioss相關抗體
