目錄
? 前言
? 新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）臨床診斷中RT-PCR方法的假陰性問題
?RT-PCR方法對檢測設(shè)備或平臺要求較高
?核酸檢測耗時較長
?急需快速準(zhǔn)確診斷COVID-19的方法
?COVID-19臨床診斷中抗體檢測法假陽性的原因
?新型冠狀病毒（SARS-COV-2）抗原檢測法的優(yōu)勢
?SARS-COV-2抗原快速檢測試劑盒簡介
?COVID-19抗原法快速診斷的優(yōu)勢
前言
2019年底，中國武漢發(fā)現(xiàn)了新冠綜合癥（COVID-19），其病原體最早由中國科學(xué)家鑒定為一種不同于以往的新型冠狀病毒，并第一時間向全球發(fā)布了其全基因序列，病毒最初定名為2019-nCoV。
由于其序列及感染癥狀與2003年引起SARS爆發(fā)的冠狀病毒相似，世界病毒學(xué)會將其定名為SARS-COV-2?，F(xiàn)在，該病毒已經(jīng)引起世界范圍COVID-19大規(guī)模流行，目前已有累計超過40萬人被確診，死亡人數(shù)超過1萬8千人，這一數(shù)字仍在快速增長。
COVID-19癥狀表現(xiàn)
面對來勢洶洶的傳染病的大規(guī)模流行，大量人群需要被篩查、確診并做相應(yīng)的處理，臨床對診斷試劑的需求極為迫切。除口罩、防護服等醫(yī)療用品外，在武漢疫情早期以及現(xiàn)在的意大利、西班牙等國都出現(xiàn)了檢測試劑的巨大缺口。
對于病原體的檢測，PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法是可以最早被應(yīng)用的方法。制備病毒核酸特異性引物序列相對較快，核酸檢測的理論特異性和靈敏度都很高，因此基于PCR方法的病毒核酸檢測試劑盒成為此次針對新冠病毒檢測最早被開發(fā)的試劑盒。
在中國的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中，實時熒光RT-PCR陽性被作為新冠病毒感染的確診證據(jù)之一。然而，在實際診斷過程中，核酸法卻暴露出很多問題：
假陰性問題；
設(shè)備或檢測平臺要求較高；
時間較長；
新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）臨床診斷中RT-PCR方法的假陰性問題
首先，假陰性意味著漏檢，不僅會導(dǎo)致臨床中對疑似患者不能快速確診，而且會使漏檢者成為潛在的病毒傳染源。
其次，據(jù)報道，甚至出現(xiàn)了多次核酸檢測陰性而出院的患者又再次復(fù)發(fā)的情況，也很可能屬于假陰性引起的誤診。
理論上核酸檢測法特異性和靈敏度都是比較高的，低含量的病毒仍可以被檢測到。造成“假陰性”這一問題可能與多種因素有關(guān)，大致分為采樣問題、試劑盒問題及陽性標(biāo)準(zhǔn)問題這樣幾個方面。
采樣問題：
1.1 呼吸道標(biāo)本：
由于新冠肺炎最常見感染肺及下呼吸道（還包括其它組織感染），因此樣本中病毒載量肺泡灌洗液>痰>咽拭子，當(dāng)使用咽拭子采樣時，病毒載量可能較低，檢測結(jié)果取決于所用試劑盒的最低檢測限；
1.2 取樣操作標(biāo)準(zhǔn)化：取樣位置、力度等需要標(biāo)準(zhǔn)化；
1.3 樣本制備及保存：
首先，臨床樣本一般采集量有限，這對核酸提取存在挑戰(zhàn)。其次，樣本中可能存在多種復(fù)雜成分影響核酸的提取。而如果核酸提取純度低，將影響下游的PCR反應(yīng)，因此當(dāng)病毒總量低時，容易造成假陰性結(jié)果；
由于呼吸和飲食都通過咽部，咽部存在大量微生物，樣本采集過程中會不可避免混入核酸酶。核酸酶穩(wěn)定性很高，一般的滅菌等清除或抑制試劑很難完全消除酶活性，它會造成樣本中核酸被降解，核酸檢測缺乏模板，因而檢測結(jié)果為陰性；
試劑盒問題：
2.1 試劑盒本身設(shè)計造成的靈敏度問題：
由于核酸檢測試劑盒設(shè)計時需要在特異性和靈敏度之間平衡，比如使用多重PCR可以提高特異性，但多對引物之間的相互干擾可能會造成靈敏度降低。但如果不使用多重PCR，則一旦所選則的靶位點核酸序列產(chǎn)生突變，就會造成試劑盒失效。因而檢測陰性可能與試劑盒的設(shè)計有關(guān)；
2.2 由于疫情發(fā)展嚴(yán)重，大量試劑廠商在搶時間生產(chǎn)，這可能造成試劑之間的精準(zhǔn)度有差別。
陽性標(biāo)準(zhǔn)問題：
陽性病例需要經(jīng)過綜合判斷，之所以稱為“假陰”通常是通過臨床癥狀等確認為陽性。但臨床癥狀可能與病程發(fā)展有關(guān)，病程初期及經(jīng)過抗病毒治療后，病毒載量可能較低，造成核酸檢測陰性。
RT-PCR方法對檢測設(shè)備或平臺要求較高
在采樣后，核酸檢測還包括核酸提取和PCR擴增兩個步驟，所采用的試劑盒和設(shè)備包括核酸提取試劑盒、熒光探針、以及熒光RT-PCR儀等。高靈敏度的RT-PCR儀價格不菲。
另外，為避免空氣中各種微生物可能帶有的核酸酶的影響，核酸檢測對實驗室的潔凈度要求也較高。
最后，核酸檢測是一項精密的實驗，對操作人員的要求也較高，需要經(jīng)過專門的操作培訓(xùn)。這使得在大規(guī)模疫情爆發(fā)時，各大醫(yī)院具有核酸檢測資質(zhì)的實驗室很快被飽和，大量樣本堆積無法及時獲得檢測。
核酸檢測耗時較長
完成一個RT-PCR的檢測通常需要4-6個小時，然而考慮到樣本運輸、大量樣本積壓的情況，通常最快24小時才可以報告結(jié)果。
據(jù)報道，在湖北，將樣本送到實驗室要花幾個小時，而結(jié)果的發(fā)布要花幾天時間。當(dāng)?shù)匦l(wèi)生部門表示，這些實驗室每天可以進行6千個檢測，但是工作人員全天候工作，也沒有足夠的實驗室能夠應(yīng)付這樣的工作量。
急需快速準(zhǔn)確診斷COVID-19的方法
由于核酸檢測在診斷中所暴露出的問題，除CT等臨床癥狀指標(biāo)外，臨床醫(yī)生急需一種能夠快速診斷COVID-19的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對人群的大規(guī)模篩查。
《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中，將病人血清學(xué)指標(biāo)，針對新冠病毒的特異性抗體IgM或IgG陽性，作為診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，該方法被稱為抗體檢測法。
抗體檢測法基于人體對于外源病原體的免疫反應(yīng)。當(dāng)感染病原體后，人通常在7-10天在血清中出現(xiàn)針對該免疫原的特異性抗體IgM，它們是機體抗感染的“先頭部隊”。如果血清中檢出病原體特異性IgM，提示新近發(fā)生感染，可用于感染的早期診斷。通常在20天后，可以檢測到針對病原體的特異性IgG。
(人體在病原刺激后的體液免疫反應(yīng)曲線)
然而在實際診斷過程中，抗體檢測法卻暴露出多種問題，不能單獨作為診斷指標(biāo)用于篩查，只能作為當(dāng)核酸檢測為陰性時的輔助診斷方法。
在FDA的SARS-COV-2檢測指導(dǎo)中明確指出，抗體檢測不能單獨用于新冠病毒診斷，不能排除感染或說明感染狀態(tài)。有其它病毒如HKU1、NL63、OC43或229E等的既往或現(xiàn)時感染時抗體檢測也可能呈陽性。
FDA新冠病毒檢測指導(dǎo)（Issued on the web on March 16, 2020.）
COVID-19臨床診斷中抗體檢測法假陽性的原因
首先，假陽性診斷將使得未感染的人被送至隔離點，有可能造成感染，其密切接觸者被隔離，也造成社會資源的浪費。
SARS-COV-2（或2019-nCoV）特異IgM和IgG抗體檢測出現(xiàn)假陽性的原因是什么？根據(jù)國家臨床檢驗中心的分析，主要是由于陽性判斷值的設(shè)定、樣本的內(nèi)源和外源干擾物質(zhì)造成。但從根本上講，是由于大部分抗體檢測試劑盒在方法學(xué)上的固有缺陷造成的。
1、 陽性判斷值的設(shè)定
每種檢測試劑盒在研發(fā)時，都需要通過對大量陰性和陽性樣本的檢測，得出檢測結(jié)果分布圖，如下圖所示。陰性和陽性樣本的檢測值往往會有一定交疊，這意味著一部分弱陽性結(jié)果實際上為假陽性。因此，需要設(shè)定合理的陽性判斷值，以減少假陽性的產(chǎn)生；
2、 樣本中的干擾物質(zhì)
2.1 內(nèi)源性干擾
內(nèi)源性干擾物質(zhì)一般包括類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體、補體、因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig抗體等。在日常的臨床血清（漿）樣本中，有相當(dāng)比例的樣本不同程度的含有上述各種干擾物質(zhì)，從而可能導(dǎo)致測定結(jié)果的假陽性。
2.2 外源性干擾
外源性干擾物質(zhì)包括樣本溶血、樣本被細菌污染、貯存時間過長和凝固不全等。
3、采樣時間窗問題
由于機體體液免疫發(fā)生的時間因人而異，采樣時待檢人員血清中病毒特異性IgM或IgG的水平可能處于不同的階段，會造成檢測假陰或假陽性問題。
4、方法學(xué)缺陷
大部分抗體檢測試劑盒采用捕獲法ELISA原理實現(xiàn)對特異性抗體的檢測。即通過抗IgM/IgG的抗體，捕獲樣本中的IgM或IgG。如果是病原體特異性的IgM或IgG，它將結(jié)合帶有標(biāo)記的抗原，從而在試紙條的檢測線或96孔板的相應(yīng)孔中顯現(xiàn)出來。
由于捕獲抗體（抗IgM/IgG抗體）會結(jié)合血清中的任何IgM或IgG，因此該方法的特異性僅基于一對抗原-抗體的特異性識別和結(jié)合（即血清中的抗體識別試劑盒所提供的病毒蛋白）。這造成了在復(fù)雜的樣本成分中，由于非特異性結(jié)合而引起的假陽性
捕獲法ELISA原理圖
新型冠狀病毒（SARS-COV-2）抗原檢測法的優(yōu)勢
抗體識別和結(jié)合抗原上的某個表位（或抗原決定簇），如果這個表位序列與其它非靶點蛋白的某段序列或表位相似，則可能造成抗體與非靶點蛋白結(jié)合，這稱為交叉反應(yīng)（Cross-reactivity）。交叉反應(yīng)是免疫反應(yīng)普遍存在的一種現(xiàn)象。
交叉反應(yīng)
如果使用兩種抗原特異性抗體去識別和結(jié)合一個靶點抗原的不同表位，則可以大大降低這種交叉反應(yīng)的幾率。簡單的數(shù)學(xué)描述就是，假設(shè)一個抗體與非特異靶點的交叉反應(yīng)幾率為1/100，當(dāng)使用兩種不同表位抗體識別時，這個幾率將降為1/10000。兩種抗體檢測一種抗原的檢測方法被稱為雙抗夾心法，抗原檢測試劑盒多采用這種方法。
雙抗夾心法ELISA原理圖
SARS-COV-2抗原快速檢測試劑盒簡介
依據(jù)雙抗夾心ELISA原理，通過免疫層析技術(shù)制備的新冠病毒抗原快速檢測試劑盒核心組成如下圖所示，樣本滴加在樣本墊上，通過液相層析依次通過結(jié)合墊，NC膜上的檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）。
抗原快速檢測試紙條示意圖
結(jié)合墊內(nèi)含有標(biāo)記的抗原特異性抗體，可以與樣本中的抗原（病毒蛋白）發(fā)生結(jié)合，當(dāng)液流到達檢測線（T線）時，固定在這條線上的第二種抗原特異性抗體再次與抗原結(jié)合，將會呈現(xiàn)陽性結(jié)果。質(zhì)控線（C線）包被IgG抗體，可以結(jié)合樣本墊中抗體，用于判斷層析過程是否順利。
抗原檢測試劑盒反應(yīng)原理
下圖分別顯示陽性、陰性和測試失敗的情況。如果質(zhì)控線（C線）未顯色，則測試失敗，需要重新檢測。
抗原檢測試劑盒結(jié)果判斷
COVID-19抗原法快速診斷的優(yōu)勢
為滿足快速診斷的需求，利用免疫層析技術(shù)開發(fā)的快速檢測試劑盒具有很多優(yōu)點：
快速：
檢測一個樣本僅需10-15分鐘，可以做到現(xiàn)場快檢。RT-PCR方法需要4-6小時才能得到檢測結(jié)果，且由于設(shè)備等原因，不能做到現(xiàn)場快檢。
操作簡便，無需特殊設(shè)備和人員培訓(xùn)：
RT-PCR方法檢測需要熒光定量PCR儀。
特異性高：
雙抗夾心法保證了抗體交叉反應(yīng)低，從而有效提高了免疫學(xué)方法的特異性，減少假陽性的發(fā)生。
靈敏度穩(wěn)定：
理論上，由于核酸檢測可以將病毒模板擴增，其靈敏度高于免疫學(xué)檢測方法。但在實際臨床使用中，由于前述對樣本制備的要求較高，造成核酸法診斷假陰性較高。而免疫學(xué)方法對樣本的要求相對較低，抗原蛋白較穩(wěn)定，因而抗原檢測試劑盒靈敏度表現(xiàn)穩(wěn)定。
新型冠狀病毒綜合癥（COVID-19）實驗室診斷方法比較：
總之，新型冠狀病毒（SARS-COV-2）抗原檢測法可有效減少RT-PCR法的假陰性和抗體檢測法的假陽性問題，診斷快速、準(zhǔn)確、對設(shè)備和人員要求低，其特點適合大規(guī)模新冠病毒感染疑似病例的快速排查，對疫情集中暴發(fā)的快速排查非常有效。也可以作為出院病例核酸檢測的再次確診方法，避免假陰性患者出院造成新的傳播風(fēng)險。（注：用于臨床需用有證產(chǎn)品）
SARS-CoV-2研究產(chǎn)品推薦
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleoprotein ELISA Kit
SARS-CoV-2 重組N蛋白
| 產(chǎn)品編號 | bs-41408P |
| 英文名稱 | Recombinant SARS-CoV-2 N Protein (His tag) |
| 序列 | Recombinant SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein (full length) (His tag) |
| 分子量 | 46kDa |
| 純度 | ≥90% |
SARS-CoV-2 重組N蛋白抗體
|
英文名稱 |
產(chǎn)品編號 |
克隆類型 |
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Anti-SARS-CoV-2N protein antibody |
Rabbit pAb |
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Mouse mAb |
SARS CoV 相關(guān)產(chǎn)品
重組蛋白產(chǎn)品
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英文名稱 |
產(chǎn)品編號 |
|
Recombinant SARS N protein |
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|
Recombinant SARS-CoV-2 N protein-C |
bs-41409P |
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Recombinant SARS-CoV-2 Spike Protein S1 |
bs-41405P |
| Recombinant SARS-CoV-2 Spike Protein RBD | bs-41407P |
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英文名稱 |
產(chǎn)品編號 |
克隆類型 |
|
Anti-SARS spike glycoprotein S1 antibody |
Rabbit pAb |
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Anti-SARS S-protein antibody |
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Anti-SARS putative orflab polyprotein antibody |
||
|
Anti-SARS N antibody |
Mouse mAb |
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ACE2 抗體產(chǎn)品
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英文名稱 |
產(chǎn)品編號 |
克隆類型 |
|
Anti-ACE2
|
Rabbit pAb
|
|
| bsm-52614R |
Rabbit mAb |
|
產(chǎn)品類別 |
英文名稱 |
產(chǎn)品編號 |
克隆類型 |
| 抗體 | Anti-SARS-CoV-2 Spike Protein S | bs-24382R |
Rabbit pAb |
| bs-24383R | |||
| bs-24384R | |||
| 重組蛋白 |
SARS-CoV-2 Spike Protein S2 |
bs-41406P |
-- |
