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免疫組化抗原熱修復(fù)的技術(shù)要點(供參考)
發(fā)表者:北京博奧森生物      發(fā)表時間:2016-2-15
1、 抗原熱修復(fù)溫度和時間的關(guān)系 我們?nèi)粘9ぷ髦兴褂玫慕M織固定液福爾馬林會引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連,具體過程如下: 第一步基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的化合物 第二步基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的亞甲基橋 上述反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉,而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復(fù)的兩個最關(guān)鍵的因素是溫度和時間,有人將這兩種因素對抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下面的公式: 抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度(T) × 加熱時間(t) 也就是說當(dāng)我們修復(fù)時的溫度越低則需要修復(fù)的時間就越長;反過來當(dāng)修復(fù)溫度增高時修復(fù)的時間可以適當(dāng)?shù)乜s短,才能使抗原決定簇完全暴露,這種反比的關(guān)系從抗體的實驗結(jié)果表1中也可以清楚地看出。 時間和溫度對染色的影響 時間(分鐘) 100℃ 80℃ 60℃ 10 + + + ― ― 30 + + + + + + + ― 50 ― + + + + + 10小時 ― ― + + 如果修復(fù)強度不夠,免疫組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復(fù)后暴露的部分抗原決定簇,而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會非常弱,或出現(xiàn)假陰性,即使是陽性結(jié)果,充其量只能起到定性的作用,不能適應(yīng)今后對免疫組化進(jìn)行定量的需要。這就給我們診斷中定量指標(biāo)的應(yīng)用帶來困難,例如用來測定耐藥的指標(biāo)。 2、 組織固定時間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系 大量的實驗表明,固定時間越長的標(biāo)本,它所形成的橋連就越緊密,抗原就越難以被激活,所需要的修復(fù)強度也就越強。有意思的是隨著固定時間的延長,組織中蛋白對溫度的耐受也相應(yīng)增高(如圖1所示),這可能就是我們對固定時間長的標(biāo)本加大修復(fù)強度的理論基礎(chǔ)。 圖一 固定時間和變性的關(guān)系 這就提醒我們在做回顧性的研究時一定要注意所使用的修復(fù)條件,它與新鮮標(biāo)本的修復(fù)條件一定是有所區(qū)別的,同等條件下一定要加長修復(fù)的時間或提高修復(fù)所使用的溫度,才可能得到比較滿意的結(jié)果。 3、 不同PH值抗原修復(fù)液對染色結(jié)果的影響 抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液PH值也會對染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。PH值對染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況。 A―穩(wěn)定型,PH值對染色結(jié)果影響不大,如PCNA、AE1、EMA、CD20等。 B―V型,高PH值和低PH值染色較好,而PH值4-5染色結(jié)果較差,如ER、Ki-67等。 C―上升型,隨著PH值的增加,染色結(jié)果逐漸增強,如HMB45等。 D―下降型,隨著PH值的增加染色結(jié)果逐漸減弱,當(dāng)然這種類型的抗體只是個別的現(xiàn)象,如MOC31。 一個有趣的現(xiàn)象值得注意,即在高PH值(圖中圓圈所示約PH8.0~9.0),A、B、C三者都有較好的染色結(jié)果,所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高PH值得修復(fù)液,如1mMEDTA, PH8.0或PH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣,絕大多數(shù)醫(yī)院和實驗室都在使用PH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況,考慮到臨床工作的實際情況,許多國外免疫組化專家建議,在常規(guī)的免疫組化工作中,全部選用高PH值得修復(fù)液來代替目前廣為使用的PH6.0枸櫞酸緩沖液。為此,本公司已經(jīng)推出PH8.0和PH9.0的新型抗原修復(fù)液。經(jīng)驗證,絕大多數(shù)的抗體使用PH9.0得修復(fù)液效果都要優(yōu)于PH6.0的枸櫞酸,尤其是核陽性的抗體。所以,在常規(guī)的免疫組化工作中,使用高PH值的抗原修復(fù)液是今后的必然趨勢。 4、 抗原熱修復(fù)的手段 微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)的比較 溫度 壓力 v時間 受熱 微波爐 100℃ 1P 15~20分鐘 不均勻 高壓鍋 120℃ 1.2P 噴氣2分鐘 均勻 目前抗原熱修復(fù)所采用的方法主要有微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)兩種,從表中可以看出,由于高壓鍋修復(fù)具有溫度均一、節(jié)省時間、效果穩(wěn)定等特點,已經(jīng)越來越受到人們的青睞。 石蠟切片免疫組化染色步驟 三步法(以SP試劑盒為例) ●石蠟切片脫蠟至水。 ●蒸餾水沖洗,PBS浸泡5分鐘,如果采用抗原修復(fù),可在此步后進(jìn)行。 ●3%H2O2室溫孵育5~10分鐘,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,PBS沖洗,2分鐘×3次。 ●5~10%正常山羊血清封閉,室溫孵育10分鐘。傾去血清,勿洗,滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小時或4℃過夜。 ●PBS沖洗,2分鐘×3次。 ●滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋),37℃孵育10~30分鐘;或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液,37℃或室溫孵育10~20分鐘。 ●PBS沖洗,2分鐘×3次。 ●滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋),37℃孵育10~30分鐘;或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37℃或室溫孵育10~20分鐘。 ●PBS沖洗,2分鐘×3次。 ●顯色劑顯色(DAB或AEC)。 ●自來水充分沖洗,復(fù)染,脫水透明、封片。 ●如果必要,可選用avdin封閉內(nèi)源性生物素。 冰凍切片的免疫組化染色步驟 ●速凍組織 ●冰凍切片4~8μm,冰凍切片后如不染色,必須吹干,儲存低溫冰箱內(nèi),或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲存于-20℃冰箱。 ●室溫放置30分鐘后,入4℃丙酮固定10分鐘。也可根據(jù)需要選擇其他的固定方式。 ●PBS沖洗,5分鐘×3次。 ●用3%過氧化氫孵育5~10分鐘,消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。 ●PBS沖洗,5分鐘×3次。 ●下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟(滴加一抗開始)。
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