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成功研發(fā)“抗人禽流感A核蛋白、禽流感B核蛋白單克隆抗體”
發(fā)表者：北京博奧森生物 發(fā)表時(shí)間：2016-2-15
我公司近期，在全體博奧森研發(fā)人員的通力合作下，成功研發(fā)制備了“小鼠抗人禽流感A核蛋白、禽流感B核蛋白單克隆抗體”為科研人員提供有力，方便的研究工具。
禽流感的發(fā)病機(jī)理及流行病學(xué)簡(jiǎn)介
人禽流行性感冒(以下稱人禽流感)是由禽甲型流感病毒某些亞型的毒株引起的急性呼吸道傳染病
1.引起禽流感(AI)的病原是禽流感病毒(AIV)該病毒屬正粘病毒科流感病毒屬
(1) 正粘病毒科的特征：正粘病毒和副粘病毒科的病毒有許多相同的特征均具有神經(jīng)氨酸酶(NA)和血凝素(HA)可凝集某些動(dòng)物的紅細(xì)胞;對(duì)呼吸道系統(tǒng)都有致病性等特別是這兩種病毒對(duì)粘多糖和糖蛋白具有特殊的親合力尤其是對(duì)細(xì)胞表面的含唾液酸的受體具有更強(qiáng)的親合力
正粘病毒科中只有一個(gè)屬即流感病毒屬根據(jù)流感病毒核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(MS)抗原性的不同將其分為ABC三個(gè)血清型它們之間抗原的差別可通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等測(cè)出ABC三型流感病毒除了其核蛋白及基質(zhì)蛋白抗原性不同外還有以下不同的生物學(xué)特性
(2) A型流感毒除有可能感染人外還感染許多其他種屬的動(dòng)物如馬豬禽類海豹等而B型則主要感染人但C型也可從豬分離到(2)A型流染病毒的表面糖蛋白比B型和C型的具有更高的變異性(3)形態(tài)特征和分子生物學(xué)特征方面A型和B型都具有8個(gè)核酸片段而C型的基因組只有7個(gè)片段
根據(jù)流感病毒血凝素HA和神經(jīng)氨酸酶NA抗原性的差異又可將其分為不同的亞型目前A型流感病毒有15種特異的HA和9種特異的NA
(3)禽流感病毒毒株分類：AIV的毒株分類基于HA和NA亞型目前已發(fā)現(xiàn)15種血凝素HA和9種神經(jīng)氨酸酶NA所有這些都是從禽流感分離物中以不同的組合鑒定出來(lái)的為了鑒定病毒的HA和NA要應(yīng)用一組對(duì)不同亞型特異的抗血清對(duì)分離物進(jìn)行血凝抑制(HI)和神經(jīng)氨酸酶抑制(NA)試驗(yàn);屬于同一亞型病毒的比較常用雞和雪豹感染后的血清及單克隆抗體進(jìn)行應(yīng)用單克隆抗體能較細(xì)致地比較同種或不同種動(dòng)物中出現(xiàn)的相關(guān)病毒之后通過(guò)HI酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(DLISA)和中和試驗(yàn)對(duì)病毒進(jìn)行比較
(4) 命名：針對(duì)AIV的命名1971年提出了流感病毒命名的標(biāo)準(zhǔn)體系1980年又進(jìn)行了修訂一株流感病毒的名稱包括型(AB或C)宿主來(lái)源(除人外)地理來(lái)源毒株編號(hào)(如果有)和分離的年代后面及圓括號(hào)內(nèi)附以HA(H)和(N)的抗原性說(shuō)明
2 . 人禽流感形態(tài)學(xué)特征:
AIV粒子一般為球形直徑為80～120納米但也常有同樣直徑的絲狀形態(tài)長(zhǎng)短不一病毒粒子表面有10～12納米的密集釘狀物或纖突覆蓋病毒囊膜內(nèi)有螺旋形核衣殼兩種不同形狀的表面釘狀物是HA(棒狀三聚體)和NA(蘑菇形四聚體)
HA的作用是將病毒粒子吸附在細(xì)胞表面受體(唾液酸低聚糖)上并與病毒的血凝活性相關(guān)在對(duì)病毒的中和作用和抗感染保護(hù)中抗HA抗體非常重要;NA酶的活性則是通過(guò)對(duì)受體內(nèi)神經(jīng)氨酸的作用可使新生病毒從細(xì)胞中釋放出來(lái)抗NA抗體對(duì)保護(hù)作用也很重要
現(xiàn)已確定血凝集H2HA和神經(jīng)氨酸N2及N9NAS的三維結(jié)構(gòu)并明確了重要的抗原區(qū)域或表位
HA和NA以及被稱為M2的小蛋白都包埋在宿主細(xì)胞質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)囊膜中病毒囊膜下為主要結(jié)構(gòu)蛋白M1位于RNA分子的周圍與分子蛋白NP和三種大蛋白(PB1PB2和PA)負(fù)責(zé) RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄
病毒基因組由8個(gè)負(fù)鏈的單鏈RNA片段組成這8個(gè)片段編碼10個(gè)病毒蛋白其中8個(gè)是病毒粒子的組成成分(HANANPM1M2PB1PB2和PA)分子質(zhì)量最小的RNA片段編碼兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2NS1與胞漿包含體有關(guān)但NS1和NS2的功能尚不清楚,現(xiàn)在已經(jīng)獲得了包括H3H5和H7在內(nèi)幾個(gè)禽亞型號(hào)HA基因的全部序列以及所有14個(gè)血凝素基因的部分序列
3.病毒的化學(xué)組成：
流感病毒粒子大約由0.8%～1.1%的RNA70%～75%蛋白質(zhì)20%～24%的脂質(zhì)和5%～8%的碳水化合物組成脂質(zhì)位于病毒的膜內(nèi)大部分為磷脂還有少量的膽固醇和糖脂幾種碳水化合物包括核糖(在RNA中)半乳糖甘露糖墨角藻糖和氨基葡糖在病毒粒子中主要以糖蛋白或糖脂的形式存在,病毒蛋白及潛在的糖基化位點(diǎn)是病毒基因組特異的但與病毒膜的糖蛋白或糖類鏈的脂質(zhì)和碳水化合物鏈的成分是由宿主細(xì)胞確定的.
4.病毒復(fù)制：
病毒吸咐在細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白受體上然后通過(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用病毒進(jìn)入細(xì)胞這包括暴露于核內(nèi)體內(nèi)的低pH導(dǎo)致HA的構(gòu)象改變介導(dǎo)膜融合這樣核衣殼便進(jìn)入胞漿并移向胞核流感病毒利用獨(dú)特的機(jī)理轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄時(shí)病毒的核酸內(nèi)切酶從宿主細(xì)胞的mRNA上切下5′帽子結(jié)構(gòu)并以此作為病毒轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的引物產(chǎn)生出6個(gè)單順子的mRNA并轉(zhuǎn)譯成HANANP和三種聚合酶(PB1PB2和PA)NS和M基因的mRNA進(jìn)行拼接每一個(gè)產(chǎn)生出兩個(gè)mRNA依不同閱讀框架進(jìn)行轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生NS1NS2M1和M2蛋白HA和NA在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)糖基化在高爾基體內(nèi)修飾然后運(yùn)輸?shù)奖砻嬷踩爰?xì)胞膜中HA需要宿主細(xì)胞蛋白酶將其裂解成HA1和HA2但兩者仍以二硫鍵相連這種裂解可生成傳染性病毒并以出芽方式從質(zhì)膜排出細(xì)胞.
5.抗原性變異：
流感病毒抗原性變變的頻率很高主要以兩種方式進(jìn)行：漂移和轉(zhuǎn)變抗原漂移可引起HA和/或NA的次要抗原變化而抗原轉(zhuǎn)變可引起HA和/或NA的主要抗原變化;
(1)抗原性漂移：抗原性漂移是由編碼HA和/或NA蛋白的基因發(fā)生點(diǎn)突變引起的是在免疫群體中篩選變異體的反應(yīng)它可引起致病性更強(qiáng)病毒的出現(xiàn)
(2)抗原性轉(zhuǎn)變：抗原性轉(zhuǎn)變是當(dāng)細(xì)胞感染兩種不同流感病毒時(shí)病毒基因組的片段特性允許發(fā)生片段重組從而引起轉(zhuǎn)變它有可能產(chǎn)生256種遺傳學(xué)上不同的毒力各異的子代病毒
6.對(duì)理化因素的抵抗力:
A型流感病毒是囊膜病毒對(duì)去污劑等脂溶劑的滅活性比較敏感福爾馬林β-丙內(nèi)酯氧化劑稀酸乙醚去氧膽酸鈉羥胺十二烷基硫酸鈉和銨離子能迅速破壞其傳染性禽流感病毒沒(méi)有超常的穩(wěn)定性因此對(duì)病毒本身的滅活并不困難病毒可在加熱極端的pH值非等滲和干燥的條件下失活
在野外條件下流感病毒常從感染禽的鼻腔分泌物和糞便中排出病毒受到這些有機(jī)物的保護(hù)極大地增加抗滅活的抵抗力此外流感病毒可以在自然環(huán)境中特別是涼爽和潮濕的條件下存活很長(zhǎng)時(shí)間糞便中病毒的傳染性在4℃條件下可以保持長(zhǎng)達(dá)30～50天20℃時(shí)為7天
7.禽流感病毒的致病力及毒力:
禽流感病毒致病力的變化范圍很大流感病毒感染引發(fā)的疾病可能是不明顯的或是溫和的一過(guò)性的綜合征甚至是100%發(fā)病率和/或死亡率的疾病疾病的癥狀可能表現(xiàn)在呼吸道腸道或生殖系統(tǒng)并隨病毒種類動(dòng)物種別齡期并發(fā)感染周圍環(huán)境及宿主免疫狀態(tài)的不同而不同禽流感病毒的毒力主要決定于病毒粒子的復(fù)制速率和血凝素蛋白裂解位點(diǎn)附近的氨基酸組成
目前國(guó)際上一般按歐共體規(guī)定的靜脈內(nèi)接種致病指數(shù)(IVPI)來(lái)判定毒力當(dāng)IVPI>1.2時(shí)則認(rèn)為是高致病力毒株。
