免疫學實驗已經(jīng)成為蛋白質(zhì)科學研究領域難以替代的重要實驗方法。通過將“可以與待測分子結(jié)合的特異性抗體”和“易于被檢測到的標記物”二者相偶聯(lián)的方法，研究人員已經(jīng)獲得了高效且特異檢測樣本中靶標的有效工具。而且隨著檢測手段的更新迭代，越來越多的標記物類型也花樣翻新，大有“亂花漸欲迷人眼”之勢。那么，如何才能在種類繁多的抗體偶聯(lián)物中找到合適自己的那一個呢？今天就讓我們?yōu)槟銚荛_迷霧，一探究竟。
其實，作為標記的偶聯(lián)物種類雖多，但其實最常用偶聯(lián)物只有3個大類，即：酶標記、熒光標記和生物素標記。
酶標記的首選毫無疑問是辣根過氧化物酶 (HRP) 。HRP能通過催化有過氧化氫參與的一系列氧化還原反應并釋放信號，而被廣泛應用于免疫印跡 (WB), 酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA), 以及免疫組織化學 (IHC) 等實驗中。由于HRP自身穩(wěn)定性強且催化效率高，因此可以通過很簡單的操作，有效放大中低豐度靶標的信號，因此能夠適應大多數(shù)檢測情境。酶標記中的另外一種是堿性磷酸酶 (AP) 標記，常常是通過催化磷酸酯底物的去磷酸化顯色反應而達到檢測目的。與HRP相比，AP標記過程中酶活性損失更大、穩(wěn)定性低且反應時間長，因此對制備和檢測操作都提出了較高要求。但是得益于AP獨特的最適pH和催化穩(wěn)定性，這使得AP在堿性條件或?qū)Y(jié)果穩(wěn)定性要求苛刻的特殊場合下，具有比HRP更好的工作性能。
HRP標記往往是樣本單靶點檢測的首選，但當需要對同一樣本中的多個靶點進行多通道檢測時，熒光標記抗體則提供了一種更好的選擇。各類熒光標記，如：AF系列、Cy系列、FITC、羅丹明等為研究人員們提供了極大地選擇空間，因此被廣泛應用于免疫熒光染色 (IF), 流式細胞術 (FC), 和熒光免疫印跡 (FWB)實驗中。選擇熒光標記時，熒光相對強度和光譜分離度的選擇最為重要。由于激光光源、檢測設備等的不同，不同的熒光標記在不同的設備上具有不同的熒光強度。因此，選擇熒光標記物時，需要結(jié)合實驗室設備的特點和蛋白豐度，以確保最亮的標記物和表達水平最低的蛋白相互組合。此外，“串光”問題會在熒光實驗中帶來非常大的不利影響，并直接影響結(jié)果的可信度。因此，熒光標記物發(fā)射光譜應盡可能地彼此遠離，以避免鄰近通道間熒光信號的串擾。如果難以確認最佳熒光標記的種類，優(yōu)先去嘗試AF488, Cy5, FITC, PE等文獻中最常用到的熒光標記通常是較為穩(wěn)妥的選擇。
好的開始是成功的一半，辛苦實驗的你不需要為選擇標記抗體而苦惱。給博奧森一份信任，我們還你的不只是一支好抗體！
