技術介紹
CRISPR/Cas9 是一種基于細菌天然免疫機制開發(fā)出來的基因編輯技術,用于抵御病毒等外來物入侵的一種防御機制。經(jīng)改造的CRISPR系統(tǒng)主要由Cas9蛋白和單鏈向?qū)NA(sgRNA)組成,其中sgRNA對靶序列進行特異性識別,Cas9蛋白負責對識別的靶序列進行切割,從而實現(xiàn)DNA的雙鏈斷裂。
DNA雙鏈斷裂后,細胞對DNA的損傷修復機制就會被激活。目前主要有兩種修復機制,非同源末端連接(NHEJ)修復和同源重組介導的修復(HDR)。沒有外源模板時,機體主要進行NHEJ修復。NHEJ修復過程中,會在切割位點隨機的進行缺失或插入堿基序列,導致DNA移碼突變,從而使基因不能正常表達。存在外源模板的情況下,機體會啟動HDR修復來實現(xiàn)基因的精準插入或者替換。
KO 細胞系的應用
目前,利用CRISPR-Cas9構建基因敲除(KO)細胞系的技術已經(jīng)越來越成熟,那么KO細胞系的應用有哪些?可以幫助我們解決什么問題呢?基因功能研究
由于模式生物基因組測序系統(tǒng)的逐漸完善,使CRISPR/Cas9技術在基因組中同時進行多靶位點的編輯成為可能。研究表明將缺失突變引入不同基因的編碼外顯子中,可以在人細胞中當做強大的陰性和陽性篩選對照。與先前的 RNAi 技術的脫靶嚴重、編輯效率低及僅限于轉(zhuǎn)錄過程相比,CRISPR/Cas9技術介導的篩選可更好的實現(xiàn)專一性和敏感性,設計的sgRNA可以靶向任何 DNA 序列。RNAi 方法只導致基因表達抑制,而CRISPR/Cas9技術產(chǎn)生的Indels可以致使基因功能喪失,比RNAi 出現(xiàn)更加明顯的表型,這更容易鑒定目的基因。
藥物靶點的確定
利用CRISPR-Cas9技術建立基因缺失病變的KO細胞模型,有助于研究疾病的發(fā)病機制和篩選潛在的藥物靶點,并通過高通量藥物反應數(shù)據(jù),初步篩選出在特定藥物處理下細胞存活率變化顯著的細胞系,進而評估藥物對特定基因敲除細胞的影響,從而篩選出有效的藥物候選物。從基因的功能研究到藥物靶點的篩選,再到藥物效果的評估及驗證,KO細胞系提供了一個強有力的實驗平臺,加速了新藥的研發(fā)進程。同時,KO細胞系不僅在細胞層面上有所應用,還可以用于構建動物模型,進一步研究藥物在體內(nèi)的作用機制和治療效果,尤其是在遺傳性疾病的治療研究中發(fā)揮著巨大作用。
抗體的特異性鑒定
抗體是生命科學研究中的常用試劑之一,抗體的特異性對研究者們至關重要??贵w的特異性是指抗體能夠識別并結合到其目標抗原的能力,而不與其他非目標分子發(fā)生交叉反應。特異性抗體可以減少實驗中的誤差,降低了非目標分子的干擾,有助于提高實驗的可重復性,使實驗結果更加可靠。
目前,基因敲除驗證(KO)是廣受信任且接受度最為廣泛的抗體特異性驗證方法之一。利用CRISPR-Cas9技術,構建目的基因缺失的KO細胞系。如果抗體是特異性的,那么不應該檢測到信號,而在野生型(WT)細胞系中則應該檢測到特異性靶蛋白的信號。KO細胞系提供了真正意義上的陰性對照,一度被稱為“抗體特異性驗證的金標準”,以確認抗體對目標蛋白的特異性。
PART.1 隆重推出 KO 系列產(chǎn)品
同時提供KO細胞系以及對應的KO裂解液
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KO驗證的特異性抗體
Bioss提供熱門指標的KO驗證抗體列表,驗證進程仍在繼續(xù):
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PART.2 CRISPR/Cas9基因敲除技術服務
服務編號:SV1501
一、服務內(nèi)容與流程
服務內(nèi)容:
Tip: 請您填寫項目申請表,以便Bioss為您提供更好的技術服務。
服務流程:
1.客戶提供需要敲除的指標信息,與公司商定具體的制備項目、數(shù)量和費用,雙方簽訂《委托CRISPR/Cas9基因敲除服務合同》。
2.雙方確定合作細節(jié),實驗過程中及時反饋實驗進程,并按照規(guī)定時間完成委托服務。并向客戶提供委托產(chǎn)品與實驗報告。
二、技術流程
1.RNP轉(zhuǎn)染法
2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法
三、案例結果展示
四、服務優(yōu)勢
1.兩種敲除方法(質(zhì)粒法和RNP法)可供客戶選擇。
2.每個靶標設計多條sgRNA,提供多種敲除策略,最大限度的提高的KO效率,提高蛋白水平的敲除概率。
3.通過Sanger測序后,多種軟件分析編輯效率,提高編輯結果的準確性。
4.不同的細胞系具有專屬的轉(zhuǎn)染方案,提高靶標編輯的效率。